Signatures épigénétiques du gène suppresseur de tumeur RARb2

Le cancer est une maladie complexe de par son étiologie multiple. Les gènes suppresseurs de tumeurs, véritables gardiens du génome, peuvent être mis sous silence par une répression épigénétique anormale qui présente l'avantage thérapeutique d'être réversible. Afin d'étudier ce phénomène, nous avons focalisé nos études sur le récepteur à l acide rétinoïque beta 2 (RARb2) dont la méthylation du promoteur conduit à sa perte d'expression dans les cancers de la prostate et du sein. L'étude de son profil épigénétique dans plusieurs modèles cellulaires a montré que la méthylation de l'ADN et la répression par les protéines polycomb pouvait co-exister sur ce locus. Pourtant, ces deux mécanismes répressifs sont décrits comme mutuellement exclusifs. Nous avons recherché l'existence d'ARN non codants associés au promoteur de RARb2 et pouvant guider cette répression épigénétique mais de tels ARN n'ont pas été identifiés. Nous avons ensuite mis en place un système d'expression inductible de la protéine polycomb EZH2 dans une lignée prostatique qualifiée de "pré-tumorale". Ce modèle original est destiné à éprouver l'hypothèse du ciblage de l'hyperméthylation par les protéines polycomb sur le gène modèle RARb2 avant d'étendre les analyses à l'échelle génomique. Enfin, nous nous sommes intéressés à un niveau supérieur de régulation de l'expression des gènes, l'organisation nucléaire. Nous avons abordé cette problématique complexe par des études de microscopie et nous montrons que le positionnement de RARb2 dans l'espace nucléaire ne semble pas être corrélé à son état d'expression. De manière intéressante, nous avons identifiés des foyers de protéines polycomb dans les cellules tumoralesToday it has become clear that epigenetic alterations also are critical in the initiation and the progression of the disease. In fact tumor suppressor genes, that prevent tumorigenesis, can be abnormally silenced by epigenetic factors. As epigenetic repression is reversible, the understanding of such deregulation is of great interest and opens new therapeutic perspectives. In order to study this phenomenon, we chose as model the retinoic acid receptor beta 2 (RARb2), a tumor suppressor gene which expression is lost in prostate and breast cancers by DNA methylation. Upon studying several cell models, we actually found that DNA methylation and polycomb repression can co-occur at this locus, although these distinct epigenetic processes are usually described as mutually exclusive. We investigated the existence of non-coding RNA associated to RARb2 promoter that could direct epigenetic silencing. Such RNAs were not identified in our models. Then, we developed an inducible expression system of EZH2, a polycomb protein, in a pre-tumoral prostate cell line. This original model will be useful to test the hypothesis according to which polycomb protein can target DNA hypermethylation. RARb2 will be the model gene before performing genome-wide analysis that will allow to find the genes targeted by polycomb repression in prostate tumorigenesis. Finally, we got interested in how higher order of chromatin architecture influences gene regulation. We addressed nuclear organization by microscopy studies and showed that RARb2 position seems not to be correlated with its transcriptional level. Interestingly, we found polycomb spots in human cancer cellsPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Nouvelle approche anti-tumorale (ciblage de la camptothécine vers les gènes IGF-I et IGF-IR)

Mon projet s inscrit dans le cadre du développement de nouvelles approches ayant pour objectif l inhibition des gènes IGF-I et de son récepteur IGF-IR dans les cellules cancéreuses. Pour inhiber l expression de ces gènes, nous avons utilisé la stratégie anti-gène. Il s'agit de reconnaître spécifiquement une séquence d ADN en double-hélice et de former une triple-hélice locale entre l ADN cible et un oligonucléotide synthétique (OFT). La stratégie que j ai développée repose, en particulier, sur l utilisation des OFTs comme guide pour positionner des inhibiteurs de topoisomérase I, et plus précisément la camptothécine (CPT), uniquement aux sites d intérêts. Pour cela, nous avons synthétisé des conjugués OFT-CPT, que nous avons validés in vitro puis ex vivo sur un modèle d'hépatocarcinome de rat contenant un gène rapporteur et dans les cellules humaines du cancer de la prostate, DU145. Les résultats ont été validés par l utilisation des techniques comme l ARN interférence, la PCR quantitative en temps réel et la visualisation par immunofluorescence de foyers de gH2AX. Nous avons également appliqué cette stratégie à d autres familles de conjugués, contenant soit un autre agent de coupure de l ADN comme la bléomycine, soit un autre ligand de l ADN, comme les MGB. Globalement ce travail montre qu il est possible d accroître la spécificité d action des molécules utilisés en chimiothérapie.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Conception d'un criblage d'inhibiteurs des méthyltransférases d'ADN (vers de nouveaux modulateurs épigénétiques)

L épigénétique étudie les flux d information cellulaires réversibles et transmissibles, qui ne sont pas directement codés par la séquence de l ADN. Les principales régulations épigénétiques sont la méthylation de l ADN, les modifications des histones, la dynamique de la chromatine et les ARN non codant. Elles sont impliquées depuis la gamétogénèse jusqu à la cognition, en passant par l empreinte parentale, la différenciation, etc. La dérégulation épigénétique est un trait commun à tous les cancers. On observe dans les tumeurs une hypométhylation globale du génome induisant une instabilité et une hyperméthylation spécifique des gènes suppresseurs de tumeurs qui favorise la progression de la maladie. Les inhibiteurs des méthyltransférases d ADN (DNMTi) forment une nouvelle classe de grand intérêt, pour leur capacité à reprogrammer les cellules tumorales. Mais leur instabilité chimique et leur toxicité limitent leur usage clinique. Afin de développer des modulateurs épigénétiques plus puissants et plus spécifiques, nous avons conçu un test de criblage innovant de DNMTi à moyen/haut-débit, basé sur la détection d un signal de fluorescence. Après validation de la méthode sur une collection orientée de dérivés de flavones et flavanones qui se sont révélés plus actifs que les molécules de la littérature sur le complexe catalytique Dnmt3A/3L et ont présenté une activité spécifique sur le développement du poisson-zèbre, nous avons réalisé un criblage manuel (1200 molécules, 5,3% de hits) et un criblage automatisé (4600 molécules, 4% de hits). De nouvelles familles de DNMTi prometteuses ont pu être ainsi découvertes, pour lesquelles des relations structure-activité ont été menéesPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Inhibiteurs de méthyltransférases d'ADN (DNMT) (caractérisation et application à la recherche de partenaires protéiques)

Dans les cancers, le paysage épigénétique est altéré avec notamment une hyperméthylation ciblée des promoteurs de certains gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui participe à leur inactivation. Afin de comprendre ce phénomène, nous avons cherché à identifier de nouveaux partenaires protéiques des enzymes responsables de la méthylation de l ADN, les méthyltransférases d ADN (DNMT). L originalité du travail consiste à développer deux techniques qui utilisent des inhibiteurs de DNMT comme outil moléculaire afin d identifier les partenaires de la méthylation. La première partie du manuscrit est consacrée à la caractérisation d inhibiteurs de DNMT (Champion et al., 2010 ; Cecccaldi et al., 2011). La seconde partie décrit le développement de deux techniques fondées soit sur le principe de chromatographie par affinité, soit sur l utilisation d une sonde chimique photoactivable qui peut ponter l enzyme ou ses partenaires et être couplée à une étiquette par une réaction de click chemistryPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Preparation and characterization of dialkylcarbamato derivatives of niobium and tantalum

he mononuclear compounds M(O(2)CNR(2))(n) (M = Nb or Ta, R = Et, n = 5; M = Nb, R = Et or Pr-i, n = 4) have been prepared by treating the corresponding metal chlorides or their adducts, i,e. [NbCl4(thf)(2)](thf = tetrahydrofuran), with CO2-NHR(2) in toluene. The molecular structures of Ta(O(2)CNEt(2))(5) and Nb(O(2)CNEt(2))(4) have been solved by X-ray diffraction methods. The tantalum atom is eight-co-ordinated, being surrounded by three bi- and two mono-dentate diethylcarbamato groups, in a slightly distorted square-antiprismatic arrangement. The niobium compound consists of mononuclear units, where the niobium atom is dodecahedrally co-ordinated to eight oxygen atoms of four bidentate diethylcarbamate ligands. The reaction of [NbCl3(dme)] (dme = 1,2-dimethoxyethane) with CO2-NHR(2)(R = Et or Pr-i) gave the corresponding dialkylcarbamates; on the basis of spectroscopic and magnetic data these niobium(III) derivatives are suggested to be dinuclear with bridging and terminal carbamato groups. Improved yields of [M(2)(eta(6)-C(6)Me(6))(2)Cl-4] (M = Nb or Ta), which are the precursors to the dialkylcarbamates of niobium(II) and tantalum(II), have been obtained. The [M(2)(eta(6)-C(6)Me(6))(2)Cl-4]-CO2-NHPr2i system (M = Nb or Ta) in toluene gave metal(II) dialkylcarbamato complexes of analytical composition M(eta(6)-C(6)Me(6))(O2CNPr2i)(2): these substantially diamagnetic compounds are suggested to be dinuclear with bridging carbamato groups, a metal-metal bond and axially co-ordinated hexamethylbenzene

DNA methylome combined with chromosome cluster-oriented analysis provides an early signature for cutaneous melanoma aggressiveness

Funder Grant reference number Author Centre National de la Recherche Scientifique Centre National de la Recherche Scientifique Centre National de la Recherche Scientifique ATIP Region Midi Pyrenees-Equipe d'excellence Region Midi Pyrenees-FEDER Paola B Arimondo Paola B Arimondo Paola B Arimondo Fondation InnaBioSante EpAM Paola B Arimondo Adelson Medical Research Foundation Dave SB Hoon Matias Bustos The funders had no role in study design, data collection and interpretation, or the decision to submit the work for publication.Aberrant DNA methylation is a well-known feature of tumours and has been associated with metastatic melanoma. However, since melanoma cells are highly heterogeneous, it has been challenging to use affected genes to predict tumour aggressiveness, metastatic evolution, and patients' outcomes. We hypothesized that common aggressive hypermethylation signatures should emerge early in tumorigenesis and should be shared in aggressive cells, independent of the physiological context under which this trait arises. We compared paired melanoma cell lines with the following properties: (i) each pair comprises one aggressive counterpart and its parental cell line and (ii) the aggressive cell lines were each obtained from different host and their environment (human, rat, and mouse), though starting from the same parent cell line. Next, we developed a multi-step genomic pipeline that combines the DNA methylome profile with a chromosome cluster-oriented analysis. A total of 229 differentially hypermethylated genes was commonly found in the aggressive cell lines. Genome localization analysis revealed hypermethylation peaks and clusters, identifying eight hypermethylated gene promoters for validation in tissues from melanoma patients. Five Cytosine-phosphate-Guanine (CpGs) identified in primary melanoma tissues were transformed into a DNA methylation score that can predict survival (log-rank test, p=0.0008). This strategy is potentially universally applicable to other diseases involving DNA methylation alterations