Discovery and characterization of a prevalent human gut bacterial enzyme sufficient for the inactivation of a family of plant toxins

Although the human gut microbiome plays a prominent role in xenobiotic transformation, most of the genes and enzymes responsible for this metabolism are unknown. Recently, we linked the two-gene ‘cardiac glycoside reductase’ (cgr) operon encoded by the gut Actinobacterium Eggerthella lenta to inactivation of the cardiac medication and plant natural product digoxin. Here, we compared the genomes of 25 E. lenta strains and close relatives, revealing an expanded 8-gene cgr-associated gene cluster present in all digoxin metabolizers and absent in non-metabolizers. Using heterologous expression and in vitro biochemical characterization, we discovered that a single flavin- and [4Fe-4S] cluster-dependent reductase, Cgr2, is sufficient for digoxin inactivation. Unexpectedly, Cgr2 displayed strict specificity for digoxin and other cardenolides. Quantification of cgr2 in gut microbiomes revealed that this gene is widespread and conserved in the human population. Together, these results demonstrate that human-associated gut bacteria maintain specialized enzymes that protect against ingested plant toxins

Probing intermediates in the activation cycle of [NiFe] hydrogenase by infrared spectroscopy: the Ni-SIr state and its light sensitivity

The [NiFe] hydrogenase from the sulphate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F is reversibly inhibited in the presence of molecular oxygen. A key intermediate in the reactivation process, Ni-SIr, provides the link between fully oxidized (Ni-A, Ni-B) and active (Ni-SIa, Ni-C and Ni-R) forms of hydrogenase. In this work Ni-SIr was found to be light-sensitive (T ≤ 110 K), similar to the active Ni-C and the CO-inhibited states. Transition to the final photoproduct state (Ni-SL) was shown to involve an additional transient light-induced state (Ni-SI1961). Rapid scan kinetic infrared measurements provided activation energies for the transition from Ni-SL to Ni-SIr in protonated as well as in deuterated samples. The inhibitor CO was found not to react with the active site of the Ni-SL state. The wavelength dependence of the Ni-SIr photoconversion was examined in the range between 410 and 680 nm. Light-induced effects were associated with a nickel-centred electronic transition, possibly involving a change in the spin state of nickel (Ni2+). In addition, at T ≤ 40 K the CN− stretching vibrations of Ni-SL were found to be dependent on the colour of the monochromatic light used to irradiate the species, suggesting a change in the interaction of the hydrogen-bonding network of the surrounding amino acids. A possible mechanism for the photochemical process, involving displacement of the oxygen-based ligand, is discussed

[NiFe] Hydrogenases from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F and Aquifex aeolicus Studied by FTIR, EPR and Electrochemical Techniques: Redox Intermediates, O2/CO Sensitivity and Light-Induced Effects

[NiFe]-Hydrogenasen sind Enzyme, die die reversible Oxidation von molekularem Wasserstoff katalysieren. Das Verständnis ihres Mechanismus ist notwendig für die Synthese biomimetischer katalytischer Systeme und für ein zukünftige “grüne“ Biotechnologie. In dieser Arbeit wurden [NiFe]-Hydrogenasen aus zwei unterschiedlichen Organismen untersucht, eine aus dem streng anaeroben Bakterium Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F und eine aus dem mikro-aerophilen hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus. Der erste Teil der Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung der [NiFe] Hydrogenase aus D. vulgaris; hier wurden die Intermediate des Reaktionszyklus durch verschiedene Infrarot-Techniken im Detail untersucht. Durch Einsatz der SEIRA-Spektroskopie, bei der das Enzym an die Oberfläche einer Elektrode gebunden ist, konnte dieselbe katalytische Aktivität wie auch durch FTIR-Spektroelektrochemie in Lösung erhalten werden. Ferner wurde gezeigt, dass der EPR-inaktive Zustand (Ni-SIr)I lichtempfindlich ist und in einen neuen Zustand, Ni-SL, übergeht. Wellenlängenabhängige und kinetische Messungen zeigten, dass die Lichtempfindlichkeit des (Ni-SIr)I Zustands auf eine Verschiebung des an das aktive Zentrum gebundenen Hydroxyl-Liganden zurückzuführen ist. Für den Übergang von dem lichtinduzierten Ni-L in den Ni-C Zustand wurde ein (H/D) kinetischer Isotopeneffekt beobachtet. Dies zeigt, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieses Übergangs die Bindung eines Protons an das aktive Zentrum beinhaltet. Mittels FTIR-Spektroelektrochemie und EPR wurde die Inhibierung des Enzyms durch Kohlenmonoxid untersucht und die Bildung von zwei CO-inhibierten Zuständen gezeigt. Zusätzlich wurde die Aktivierungsenergie für die Bindung des CO an das aktive Zentrum mittels zeitaufgelöster FTIR Studien bestimmt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Hydrogenase I aus Aquifex aeolicus. Chronoamperometrische elektrochemische Messungen belegten die Sauerstofftoleranz dieser Hydrogenase. Durch FTIR-Spektroelektrochemie in Lösung konnten vier Redox-Intermediate detektiert werden, die ein signifikant höheres Redoxpotential aufweisen als die [NiFe]-Hydrogenasen aus anderen Organismen. Die Bindung von Kohlenmonoxid an das aktive Zentrum der Hydrogenase I aus A. aeolicus ist deutlich schwächer als diejenige an die Hydrogenase aus D. vulgaris. Durch EPR-detektierte Redox-Titrationen konnten verschiedene Typen von Eisen-Schwefel Zentren und alle dazu gehörigen Redoxpotentiale bestimmt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Modell für die Sauerstofftoleranz der Hydrogenase I vorgeschlagen. Abschließend wurde die Wechselwirkung des aktiven Zentrums des katalytisch aktiven Ni-C Zustands mit Wasserstoff in A. aeolicus mittels moderner EPR-Techniken untersucht, wobei ein schwach gebundenes Hydrid detektiert werden konnte

[NiFe] Hydrogenasen aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F and Aquifex aeolicus untersucht mit FTIR, EPR und elektrochemischen Methoden: Redox Intermediaten, O2/CO Sensitivität and Licht-induzierte Effecte

[NiFe]-Hydrogenasen sind Enzyme, die die reversible Oxidation von molekularem Wasserstoff katalysieren. Das Verständnis ihres Mechanismus ist notwendig für die Synthese biomimetischer katalytischer Systeme und für ein zukünftige “grüne“ Biotechnologie. In dieser Arbeit wurden [NiFe]-Hydrogenasen aus zwei unterschiedlichen Organismen untersucht, eine aus dem streng anaeroben Bakterium Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F und eine aus dem mikro-aerophilen hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus. Der erste Teil der Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung der [NiFe] Hydrogenase aus D. vulgaris; hier wurden die Intermediate des Reaktionszyklus durch verschiedene Infrarot-Techniken im Detail untersucht. Durch Einsatz der SEIRA-Spektroskopie, bei der das Enzym an die Oberfläche einer Elektrode gebunden ist, konnte dieselbe katalytische Aktivität wie auch durch FTIR-Spektroelektrochemie in Lösung erhalten werden. Ferner wurde gezeigt, dass der EPR-inaktive Zustand (Ni-SIr)I lichtempfindlich ist und in einen neuen Zustand, Ni-SL, übergeht. Wellenlängenabhängige und kinetische Messungen zeigten, dass die Lichtempfindlichkeit des (Ni-SIr)I Zustands auf eine Verschiebung des an das aktive Zentrum gebundenen Hydroxyl-Liganden zurückzuführen ist. Für den Übergang von dem lichtinduzierten Ni-L in den Ni-C Zustand wurde ein (H/D) kinetischer Isotopeneffekt beobachtet. Dies zeigt, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieses Übergangs die Bindung eines Protons an das aktive Zentrum beinhaltet. Mittels FTIR-Spektroelektrochemie und EPR wurde die Inhibierung des Enzyms durch Kohlenmonoxid untersucht und die Bildung von zwei CO-inhibierten Zuständen gezeigt. Zusätzlich wurde die Aktivierungsenergie für die Bindung des CO an das aktive Zentrum mittels zeitaufgelöster FTIR Studien bestimmt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Hydrogenase I aus Aquifex aeolicus. Chronoamperometrische elektrochemische Messungen belegten die Sauerstofftoleranz dieser Hydrogenase. Durch FTIR-Spektroelektrochemie in Lösung konnten vier Redox-Intermediate detektiert werden, die ein signifikant höheres Redoxpotential aufweisen als die [NiFe]-Hydrogenasen aus anderen Organismen. Die Bindung von Kohlenmonoxid an das aktive Zentrum der Hydrogenase I aus A. aeolicus ist deutlich schwächer als diejenige an die Hydrogenase aus D. vulgaris. Durch EPR-detektierte Redox-Titrationen konnten verschiedene Typen von Eisen-Schwefel Zentren und alle dazu gehörigen Redoxpotentiale bestimmt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Modell für die Sauerstofftoleranz der Hydrogenase I vorgeschlagen. Abschließend wurde die Wechselwirkung des aktiven Zentrums des katalytisch aktiven Ni-C Zustands mit Wasserstoff in A. aeolicus mittels moderner EPR-Techniken untersucht, wobei ein schwach gebundenes Hydrid detektiert werden konnte.[NiFe] hydrogenases are important metalloenzymes that carry out the reversible oxidation of dihydrogen. Understanding their mechanism is crucial for the synthesis of biomimetic catalytic systems and future ‘green’ biotechnology. The present work is focused on the study of two distinct types of enzymes; a [NiFe] hydrogenase from the strictly anaerobic sulphate reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F and a [NiFe] hydrogenase from the micro-aerophilic hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. The first part is centred on the study of the [NiFe] enzyme from D. vulgaris, for which the intermediates of the reaction cycle were studied in detail by infrared techniques. Using SEIRA spectroscopy the catalytic activity of this enzyme adsorbed on an electrode was monitored, yielding essentially the same results as FTIR spectroelectrochemistry in solution. The EPR silent inactive state (Ni-SIr)I was shown to be light sensitive and a new state Ni-SL could be detected. Wavelength dependence and time resolved kinetics showed that the light sensitivity corresponds to the dislocation of the hydroxyl ligand present in the active site of (Ni-SIr)I. For the transition from the light-induced Ni-L state to Ni-C a large (H/D) kinetic isotope effect was obtained, showing that the rate limiting step is the binding of a hydron at the active site. Using FTIR spectroelectrochemistry and EPR, the inhibition of the enzyme by carbon monoxide was studied and formation of two CO-adducts demonstrated. Time resolved FTIR studies at low temperatures used the reversible photolysis of the external CO ligand to estimate the activation barrier for its rebinding at the active site. The second part of this study comprises an in-depth investigation of the Hydrogenase I from Aquifex aeolicus. Chronoamperometric electrochemical measurements provided evidence for the oxygen tolerance of this hydrogenase. FTIR electrochemistry in solution detected only four redox intermediate states with significantly more positive midpoint potentials than those measured for standard hydrogenases. Carbon monoxide was shown to bind to the active site of Hydrogenase I much weaker than to that of D. vulgaris. By an EPR redox titration the types and midpoint potentials of all iron-sulphur centres were determined. Based on these results a model for the oxygen tolerance of Hydrogenase I is proposed The study is concluded by examining the interaction of the active site with the substrate in the catalytically active Ni-C state, in which a weakly bound hydride was found

The oxygen-tolerant hydrogenase I from aquifex aeolicus weakly interacts with carbon monoxide: An electrochemical and time-resolved FTIR study

International audienc

The Carbon Monoxide Dehydrogenase from Desulfovibrio vulgaris

International audienceNi-containing Carbon Monoxide Dehydrogenases (CODHs) catalyze the reversible conversion between CO and CO2 and are involved in energy conservation and carbon fixation. These homodimeric enzymes house two NiFeS active sites (C-clusters) and three accessory [4Fe–4S] clusters. The Desulfovibrio vulgaris (Dv) genome contains a two-gene CODH operon coding for a CODH (cooS) and a maturation protein (cooC) involved in nickel insertion in the active site. According to the literature, the question of the precise function of CooC as a chaperone folding the C-cluster in a form which accommodates free nickel or as a mere nickel donor is not resolved. Here, we report the biochemical and spectroscopic characterization of two recombinant forms of the CODH, produced in the absence and in the presence of CooC, designated CooS and CooSC, respectively. CooS contains no nickel and cannot be activated, supporting the idea that the role of CooC is to fold the C-cluster so that it can bind nickel. As expected, CooSC is Ni-loaded, reversibly converts CO and CO2, displays the typical Cred1 and Cred2 EPR signatures of the C-cluster and activates in the presence of methyl viologen and CO in an autocatalytic process. However, Ni-loaded CooSC reaches maximum activity only upon reductive treatment in the presence of exogenous nickel, a phenomenon that had not been observed before. Surprisingly, the enzyme displays the Cred1 and Cred2 signatures whether it has been activated or not, showing that this activation process of the Ni-loaded Dv CODH is not associated with structural changes at the active site

Cofactor composition and function of a H2-sensing regulatory hydrogenase as revealed by Mossbauer and EPR spectroscopy

The regulatory hydrogenase (RH) from Ralstonia eutropha H16 acts as a sensor for the detection of environmental H-2 and regulates gene expression related to hydrogenase-mediated cellular metabolism. In marked contrast to prototypical energy-converting [NiFe] hydrogenases, the RH is apparently insensitive to inhibition by O-2 and CO. While the physiological function of regulatory hydrogenases is well established, little is known about the redox cycling of the [NiFe] center and the nature of the iron-sulfur (FeS) clusters acting as electron relay. The absence of any FeS cluster signals in EPR had been attributed to their particular nature, whereas the observation of essentially only two active site redox states, namely Ni-SI and Ni-C, invoked a different operant mechanism. In the present work, we employ a combination of Mossbauer, FTIR and EPR spectroscopic techniques to study the RH, and the results are consistent with the presence of three [4Fe-4S] centers in the small subunit. In the as-isolated, oxidized RH all FeS clusters reside in the EPR-silent 2+ state. Incubation with H2 leads to reduction of two of the [4Fe-4S] clusters, whereas only strongly reducing agents lead to reduction of the third cluster, which is ascribed to be the [4Fe-4S] center in 'proximal' position to the [NiFe] center. In the two different active site redox states, the low-spin FeII exhibits distinct Mossbauer features attributed to changes in the electronic and geometric structure of the catalytic center. The results are discussed with regard to the spectral characteristics and physiological function of H-2-sensing regulatory hydrogenases.DFG, EXC 314, Unifying Concepts in Catalysi