The potential of urban agriculture in Montréal: A quantitative assessment

Growing food in urban areas could solve a multitude of social and environmental problems. These potential benefits have resulted in an increased demand for urban agriculture (UA), though quantitative data is lacking on the feasibility of conversion to large-scale practices. This study uses multiple land use scenarios to determine different spaces that could be allocated to vegetable production in Montréal, including residential gardens, industrial rooftops and vacant space. Considering a range of both soil-bound and hydroponic yields, the ability of these scenarios to render Montréal self-sufficient in terms of vegetable production is assessed. The results show that the island could easily satisfy its vegetable demand if hydroponics are implemented on industrial rooftops, though these operations are generally costly. Using only vacant space, however, also has the potential to meet the city’s demand and requires lower operating costs. A performance index was developed to evaluate the potential of each borough to meet its own vegetable demand while still maintaining an elevated population density. Most boroughs outside of the downtown core are able to satisfy their vegetable demand efficiently due to their land use composition, though results vary greatly depending on the farming methods used, indicating the importance of farm management

Disentangling the signaling complexity of nerve growth factor receptors by CRISPR/Cas9

The binding of nerve growth factor (NGF) to the tropomyosin-related kinase A (TrkA) and p75(NTR) receptors activates a large variety of pathways regulating critical processes as diverse as proliferation, differentiation, membrane potential, synaptic plasticity, and pain. To ascertain the details of TrkA-p75(NTR) interaction and cooperation, a plethora of experiments, mostly based on receptor overexpression or downregulation, have been performed. Among the heterogeneous cellular systems used for studying NGF signaling, the PC12 pheochromocytoma-derived cell line is a widely used model. By means of CRISPR/Cas9 genome editing, we created PC12 cells lacking TrkA, p75(NTR), or both. We found that TrkA-null cells become unresponsive to NGF. Conversely, the absence of p75(NTR) enhances the phosphoiylation of TrkA and its effectors. Using a patch-clamp, we demonstrated that the individual activation of TrkA and p75(NTR) by NGF results in antagonizing effects on the membrane potential. These newly developed PC12 cell lines can be used to investigate the specific roles of TrkA and p75(NTR) in a genetically defined cellular model, thus providing a useful platform for future studies and further gene editing

A triheptanoin-supplemented diet rescues hippocampal hyperexcitability and seizure susceptibility in FoxG1+/- mice

The Forkhead Box G1 (FOXG1) gene encodes a transcription factor with an essential role in the mammalian telencephalon development. FOXG1-related disorders, caused by deletions, intragenic mutations or duplications, are usually associated with severe intellectual disability, autistic features, and, in 87% of subjects, epileptiform manifestations. In at least a subset of the patients with FoxG1 mutations, seizures remain intractable, prompting the need for novel therapeutic options. To address this issue, we took advantage of a haploinsufficient animal model, the FoxG1+/- mouse. In vivo electrophysiological analyses of FoxG1+/- mice detected hippocampal hyperexcitability, which turned into overt seizures upon delivery of the proconvulsant kainic acid, as confirmed by behavioral observations. These alterations were associated with decreased expression of the chloride transporter KCC2. Next, we tested whether a triheptanoin-based anaplerotic diet could have an impact on the pathological phenotype of FoxG1+/- mice. This manipulation abated altered neural activity and normalized the enhanced susceptibility to proconvulsant-induced seizures, in addition to rescuing the altered expression of KCC2 and increasing the levels of the GABA transporter vGAT. In conclusion, our data show that FoxG1 haploinsufficiency causes dysfunction of hippocampal circuits and increases the susceptibility to a proconvulsant insult, and that these alterations are rescued by triheptanoin dietary treatment

Foxg1 localizes to mitochondria and coordinates cell differentiation and bioenergetics.

Forkhead box g1 (Foxg1) is a nuclear-cytosolic transcription factor essential for the forebrain development and involved in neurodevelopmental and cancer pathologies. Despite the importance of this protein, little is known about the modalities by which it exerts such a large number of cellular functions. Here we show that a fraction of Foxg1 is localized within the mitochondria in cell lines, primary neuronal or glial cell cultures, and in the mouse cortex. Import of Foxg1 in isolated mitochondria appears to be membrane potential-dependent. Amino acids (aa) 277-302 were identified as critical for mitochondrial localization. Overexpression of full-length Foxg1 enhanced mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and promoted mitochondrial fission and mitosis. Conversely, overexpression of the C-term Foxg1 (aa 272-481), which is selectively localized in the mitochondrial matrix, enhanced organelle fusion and promoted the early phase of neuronal differentiation. These findings suggest that the different subcellular localizations of Foxg1 control the machinery that brings about cell differentiation, replication, and bioenergetics, possibly linking mitochondrial functions to embryonic development and pathological conditions

The polymorphism L412F in TLR3 inhibits autophagy and is a marker of severe COVID-19 in males

The polymorphism L412F in TLR3 has been associated with several infectious diseases. However, the mechanism underlying this association is still unexplored. Here, we show that the L412F polymorphism in TLR3 is a marker of severity in COVID-19. This association increases in the sub-cohort of males. Impaired macroautophagy/autophagy and reduced TNF/TNFα production was demonstrated in HEK293 cells transfected with TLR3L412F-encoding plasmid and stimulated with specific agonist poly(I:C). A statistically significant reduced survival at 28 days was shown in L412F COVID-19 patients treated with the autophagy-inhibitor hydroxychloroquine (p = 0.038). An increased frequency of autoimmune disorders such as co-morbidity was found in L412F COVID-19 males with specific class II HLA haplotypes prone to autoantigen presentation. Our analyses indicate that L412F polymorphism makes males at risk of severe COVID-19 and provides a rationale for reinterpreting clinical trials considering autophagy pathways. Abbreviations: AP: autophagosome; AUC: area under the curve; BafA1: bafilomycin A1; COVID-19: coronavirus disease-2019; HCQ: hydroxychloroquine; RAP: rapamycin; ROC: receiver operating characteristic; SARS-CoV-2: severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; TLR: toll like receptor; TNF/TNF-α: tumor necrosis factor

La gestione del consenso informato nella sperimentazione clinica in emergenza

L’acquisizione del consenso informato nella sperimentazione clinica si configura come un processo durante il quale al paziente deve essere dato il tempo di poter valutare lo studio che lo sperimentatore gli propone, il tempo di formulare le relative richieste e ricevere tutti i chiarimenti di cui eventualmente necessita, per poi assumere una decisione consapevole. Un problema che si pone a questo proposito è quello dell’acquisizione del consenso informato nella sperimentazione clinica in situazioni di emergenza. Si tratta di situazioni in cui la finestra terapeutica non concede il tempo necessario perché il paziente possa capire fino in fondo lo studio ed esprimere un consenso critico; in alcuni casi (si pensi ad esempio al trauma cranico) la condizione del paziente è tale da renderlo privo di coscienza, quindi del tutto incapace di fornire consenso. Come conciliare allora la necessità di questo tipo di studi per il progresso della medicina d’urgenza con il rispetto del diritto all’autodeterminazione dei soggetti in studio? Come conciliare, in questi particolari casi, i diritti costituzionalmente garantiti di inviolabilità della persona e incoercibilità dei trattamenti sanitari con l’obiettivo di promozione della salute? In questo elaborato affronterò la questione evidenziando le lacune normative e mostrando le soluzioni che vengono comunemente adottate in Italia

Foxg1: intracellular localization and possible pathogenetic mechanisms in Rett syndrome

The Forkhead box G1 (FoxG1) is a transcription factor essential for the forebrain development and involved in pathogenesis of Rett syndrome. Notwithstanding the importance of this protein, little is known about the modalities by which it exerts its cellular functions. In this thesis I investigated, in cell culture and in animal model, the molecular mechanisms of Foxg1 action and the pathophysiological consequences of Foxg1 haploinsufficiency. Using fluorescence recovery after photobleaching strategy, I investigated the chromatin binding dynamics of Foxg1 in its wild-type form or carrying some Rett syndrome-causing mutations. The experiments show that GFP-Foxg1 mobile molecules have a chromatin affinity that decreases in truncated mutants with the extension of the protein deletion. Conversely, the immobile fraction does not decrease gradually with the extension of protein deletion but is significantly higher for a truncation associated with a severe phenotype, suggesting a possible dominant negative function of some RTT mutants. As already present in literature, GFP-Foxg1 localizes almost exclusively in the nucleus. However, no one reported data on Foxg1-GFP C-terminal fusion protein. Surprisingly, Foxg1 wt-GFP, in addition to the preserved nuclear localization, shows a clear mitochondrial localization. Further investigation led me to discover that Foxg1 undergoes a proteolytic cleavage and the resulting C-terminal peptide localizes to mitochondria, as evidenced by CFP-Foxg1 wt-YFP fusion protein as well as by other biochemical and immunohistochemical assays. Tripan Blue and proteinase K protection experiments in living cells show that nearly 80% of the protein reside in the mitochondrial matrix. Considering that Foxg1 does not have a classical N terminal mitochondrial targeting signal, I looked for Foxg1 amino acids able to drive a fused fluorescent tag into mitochondria and identified amino acids 277-302 as critical. A pull down experiment showed that a "mitochondrial" Foxg1 peptide interacts with some proteins involved in mitochondrial trafficking and function such as voltage dependent anion channel 1 and 2. Functionally, a C-terminal "mitochondrial" peptide of Foxg1 (aa 272-481) is able to enhance ATP production and mitochondrial membrane potential. Full length Foxg1 strikingly enhances mitochondrial potential and promotes cellular proliferation and mitochondrial fission; on the contrary, "mitochondrial" Foxg1 promotes mitochondrial fusion and an initial stage of cellular differentiation. In an animal model, I investigated the functional result of Foxg1 haploinsufficiency in mouse visual system. We chose visual system since it is known that Foxg1 is expressed in the developing retina and chiasm and the knockout mouse embryos show defects in retinal ganglion cells axonal navigation. It is also known that Foxg1 haploinsufficiency in mice results in subtle cortical defects. My data show that Foxg1+/Cre heterozygous mice have a profound impairment in visual acuity, despite a preserved retinal organization. Defects in visual cortical circuitry suggest that acuity loss may be due to altered cortical mechanisms. Taken together, these results suggest the following hypothesis: Foxg1 is a nuclear and mitochondrial protein that upon its internal processing localizes in the mitochondrial compartment and becomes a key coordination part of the machinery that brings about cell differentiation, replication and bioenergetics

Studio per la generazione di neuroni serotoninergici a partire da una linea di cellule staminali embrionali knockin Tph2EGFP(frt)

Il sistema serotoninergico è uno dei cosiddetti sistemi a proiezione diffusa: infatti i neuroni serotoninergici, che hanno i corpi cellulari a livello dei nuclei del raphe (otto nuclei distribuiti fra ponte, medulla e mesencefalo), estendono le proprie proiezioni in tutto il sistema nervoso centrale. Coerentemente con questo tipo di anatomia, la serotonina è implicata nella modulazione di numerosi processi fisiologici, quali il controllo dell’appetito, dei ritmi circadiani, del comportamento sessuale. La serotonina inoltre riveste un ruolo importante nel controllo di alcuni aspetti comportamentali ed è implicata in numerose patologie psichiatriche quali ansia, depressione, schizofrenia. Per questo motivo, anche ai fini di un eventuale riscontro in campo medico, è importante capire quali siano i geni chiave che, durante lo sviluppo, fanno sì che determinati precursori neurali differenzino in neuroni serotoninergici. Ad oggi non è stato identificato un gene master che da solo sia in grado di guidare un precursore verso un destino serotoninergico, ma tale fenotipo è il risultato dell’interazione di più fattori genetici. Tra questi rivestono una particolare importanza i geni Pet-1, Nkx2.2 e Lmx1b. Infatti in esperimenti su topi in cui la funzione di questi geni è stata alterata (topi knockout) si è potuto vedere un mancato differenziamento dei neuroni serotoninergici o una riduzione del loro numero. Inoltre mediante esperimenti di guadagno di funzione in embrioni di pollo è stato dimostrato che l’espressione ectopica mediante elettroporazione di Lmx1b e Pet-1 nei progenitori ventrali del midollo spinale in via di sviluppo, dove è già presente l’espressione di Nkx2.2 endogeno, promuove il differenziamento di neuroni serotoninergici in posizione ectopica. Ciò non succede invece nei progenitori dorsali, dove Nkx2.2 non è espresso. L’espressione combinata di Nkx2.2, Lmx1b e Pet-1 è in grado quindi di far differenziare in neuroni serotoninergici ectopici specifiche popolazioni di neuroblasti nel midollo spinale in via di sviluppo del pollo. Varie evidenze sperimentali suggeriscono comunque che, oltre a questi tre geni, numerosi altri fattori entrino in gioco nel differenziamento dei neuroni serotoninergici. Un ottimo strumento per testare possibili fattori coinvolti nel differenziamento verso un particolare tipo cellulare è costituito dalle cellule staminali embrionali (ES). Queste cellule infatti, se sottoposte ad adeguati stimoli, sono in grado di differenziare verso tutti i possibili tipi cellulari caratteristici della specie cui appartengono. Tali stimoli, che di solito mimano i segnali di specifici distretti dell’embrione, sono capaci di indurre le cellule staminali in coltura ad intraprendere un destino differenziativo piuttosto che un altro. Nel corso degli ultimi anni sono stati messi a punto numerosi protocolli sperimentali che permettono di ottenere cellule simili ai neuroblasti presenti nel tubo neurale precoce a partire da cellule staminali embrionali di topo. Per far questo, normalmente si generano corpi embrioidi (aggregati simili ad embrioni che le staminali embrionali formano se coltivate in sospensione) e successivamente si trattano le cellule con acido retinoico. A questo punto, l’espressione di fattori coinvolti nella generazione di particolari tipi neuronali può promuovere il differenziamento terminale dei neuroblasti in vitro. Una strategia sperimentale per individuare i geni coinvolti nel differenziamento serotoninergico consiste nel cercare di ottenere, da cellule staminali di topo, neuroblasti su cui testare fattori candidati, per verificare se tali fattori siano capaci di indirizzare il differenziamento verso il destino serotoninergico. Il mio lavoro di tesi si inserisce all’interno di un progetto di “expression cloning” che prevede la generazione in vettori di espressione di una genoteca di cDNA a partire da precursori dei neuroni serotoninergici, e la successiva espressione dei cDNA in una particolare linea di cellule staminali embrionali di topo modificate allo scopo di rendere visualizzabile un loro eventuale differenziamento in neuroni serotoninergici. Nel laboratorio dove ho svolto l’internato, infatti, è stata recentemente generata una linea di cellule staminali embrionali di topo knockin Tph2EGFP(frt-neo-frt). Questa linea presenta, su un allele, le sequenze codificanti per il gene reporter EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) e per il gene neo (posto tra due siti frt) che conferisce resistenza all’antibiotico neomicina, in sostituzione della sequenza codificante per la triptofano idrossilasi 2 (Tph2), l’enzima che catalizza la reazione limitante nella sintesi della serotonina. Queste cellule possono funzionare da “sensore” di differenziamento serotoninergico in quanto presentano il gene reporter EGFP sotto il controllo delle sequenze regolatorie del gene Tph2, che si attiva solo nei neuroni serotoninergici differenziati: ci si aspetta infatti che, nel caso in cui queste cellule si differenzino in neuroni serotoninergici, esse risultino verdi se osservate con microscopio a fluorescenza. Questa caratteristica le rende uno strumento utile per l’approccio di expression cloning: dall’analisi dei pool di vettori della libreria eventualmente capaci di promuovere la comparsa di fluorescenza verde sarà possibile individuare nuovi geni implicati nel differenziamento serotoninergico. Tali cellule sono state inizialmente utilizzate per la generazione di una linea di topo knockout per la Tph2 e, per la particolare conformazione del locus ricombinante, nei topi Tph2EGFP(frt-neo-frt) ottenuti il gene EGFP è silenziato a causa di una repressione trascrizionale dovuta alla presenza del gene neo, necessario per la selezione dei cloni ricombinanti al momento della generazione della linea di cellule ES. Per attivare la fluorescenza verde nei neuroni serotoninergici differenziati, i topi Tph2EGFP(frt-neo-frt) sono stati incrociati con topi esprimenti in maniera costitutiva la ricombinasi Flp: la ricombinasi Flp infatti riconosce i siti frt e promuove l’excisione del segmento di DNA tra i due siti contenente il gene neo. Il mio lavoro di tesi consiste nella validazione della linea cellulare Tph2EGFP(frt) come strumento da utilizzare per l’approccio di expression cloning. La prima parte del mio lavoro è consistita nella rimozione della repressione trascrizionale sul gene reporter EGFP presente nel locus Tph2 da parte del gene neo. Per questo ho introdotto un plasmide codificante per la ricombinasi Flp mediante elettroporazione nelle staminali Tph2EGFP(frt-neo-frt), allo scopo di promuovere l’excisione della cassetta neo nelle cellule. Dopo una prima selezione dei cloni sulla base della resistenza alla puromicina conferita dal plasmide, ho estratto il DNA dai cloni resistenti ed effettuato uno screening per PCR utilizzando degli oligonucleotidi disegnati su siti fiancheggianti la cassetta neo, per verificare che fosse saltata. Per tre cloni l’esito è stato positivo; ho poi analizzato questi cloni mediante Southern blot, confermando il risultato. Ho ottenuto così dei cloni Tph2EGFP(frt). In seguito alla rimozione della cassetta neo ho voluto verificare che tali cloni non avessero perduto la staminalità a causa dei numerosi passaggi in coltura; per questo ho valutato l’attività della fosfatasi alcalina endogena. Questo esperimento ha confermato che le cellule non avevano perso la staminalità. Il passo successivo, in vista dell’utilizzo delle cellule Tph2EGFP(frt) negli esperimenti di expression cloning, è quello di verificare che il “sensore” funzioni come atteso, cioè che le cellule siano in grado di differenziare in neuroni serotoninergici e di esprimere la EGFP come conseguenza. Per raggiungere questo scopo le cellule staminali saranno indotte ad originare neuroblasti e successivamente spinte a differenziare terminalmente in neuroni serotoninergici. Per indurre questo differenziamento terminale farò esprimere nei neuroblasti i geni Nkx2.2, Lmx1b e Pet-1, noti per la capacità di promuovere il differenziamento in senso serotoninergico in certe popolazioni di neuroblasti in vivo. A questo scopo ho generato tre vettori di espressione contenenti la sequenza codificante per i geni Pet-1, Lmx1b e Nkx2.2, che introdurrò per elettroporazione nei neuroblasti ottenuti dalle ES Tph2EGFP(frt). L’accensione della fluorescenza verde in tali cellule in seguito all’espressione dei tre geni potrà confermare la validità della linea cellulare in questione come “sensore” di differenziamento serotoninergico in vitro. Allo stato attuale sto valutando quale possa essere il metodo migliore per indurre le staminali embrionali a progredire verso neuroblasti che siano in uno stato differenziativo il più simile possibile a quello che in vivo caratterizza le cellule su cui iniziano ad agire i segnali responsabili del differenziamento in senso serotoninergico

Soft Tissue Substitutes in Periodontal and Peri-Implant Soft Tissue Augmentation: A Systematic Review

Background: Different extracellular matrix (ECM)-based technologies in periodontal and peri-implant soft tissue augmentation have been proposed in the market. The present review compared the efficacy of soft tissue substitutes (STSs) and autogenous free gingival grafts (FGGs) or connective tissue grafts (CTGs) in mucogingival procedures to increase keratinized tissue (KT) width around teeth and implants. Methods: Two independent examiners performed an electronic search on MEDLINE and the Cochrane Library based on the following PICOS format: (P) adult patients; (I) soft tissue substitutes and FGGs/CTGs; (C) STSs vs. CTGs; STSs vs. FGGs; STSs vs control; (O) KT width gain; (S) systematic reviews, randomized controlled trials. Studies published before November 2023 were included. Results: Around teeth, all biomaterials showed superior performance compared to a coronally advanced flap (CAF) alone for treating gingival recessions. However, when compared to CTGs, acellular dermal matrices (ADMs) yield the most similar outcomes to the gold standard (CTGs), even though in multiple recessions, CTGs continue to be considered the most favorable approach. The use of STSs (acellular matrix or tissue-engineered) in combination with apically positioned flaps (APF) resulted in significantly less gain in KT width compared to that achieved with FGGs and APFs. Around dental implants, free gingival grafts were deemed more effective than soft tissue substitutes in enhancing keratinized mucosa width. Conclusions: Based on the available evidence, questions remain about the alternative use of soft tissue substitutes for conventional grafting procedures using free gingival grafts or connective tissue grafts around teeth and implants

Cortical Seizures in FoxG1+/− Mice are Accompanied by Akt/S6 Overactivation, Excitation/Inhibition Imbalance and Impaired Synaptic Transmission

The correct morphofunctional shaping of the cerebral cortex requires a continuous interaction between intrinsic (genes/molecules expressed within the tissue) and extrinsic (e.g., neural activity) factors at all developmental stages. Forkhead Box G1 (FOXG1) is an evolutionarily conserved transcription factor, essential for the cerebral cortex patterning and layering. FOXG1-related disorders, including the congenital form of Rett syndrome, can be caused by deletions, intragenic mutations or duplications. These genetic alterations are associated with a complex phenotypic spectrum, spanning from intellectual disability, microcephaly, to autistic features, and epilepsy. We investigated the functional correlates of dysregulated gene expression by performing electrophysiological assays on FoxG1+/− mice. Local Field Potential (LFP) recordings on freely moving animals detected cortical hyperexcitability. On the other hand, patch-clamp recordings showed a downregulation of spontaneous glutamatergic transmission. These findings were accompanied by overactivation of Akt/S6 signaling. Furthermore, the expression of vesicular glutamate transporter 2 (vGluT2) was increased, whereas the level of the potassium/chloride cotransporter KCC2 was reduced, thus indicating a higher excitation/inhibition ratio. Our findings provide evidence that altered expression of a key gene for cortical development can result in specific alterations in neural circuit function at the macro- and micro-scale, along with dysregulated intracellular signaling and expression of proteins controlling circuit excitability