Characterization of adenosine receptors in bovine chondrocytes and fibroblast-like synoviocytes exposed to low frequency low energy pulsed electromagnetic fields

SummaryObjectiveThe present study describes the presence and binding parameters of the A1, A2A, A2B and A3 adenosine receptors in bovine chondrocytes and fibroblast-like synoviocytes. The effect of low frequency low energy pulsed electromagnetic fields (PEMFs) on the adenosine receptor affinity and density was studied.MethodsSaturation, competition binding experiments and Western blotting assays in the absence and in the presence of PEMFs on the adenosine receptors in bovine chondrocytes or fibroblast-like synoviocytes were performed. Thermodynamic analysis of the A2A or A3 binding was studied to investigate the forces driving drug–receptor coupling. In the adenylyl cyclase and proliferation assays the potency of typical high-affinity A2A or A3 agonists in the absence and in the presence of PEMFs was evaluated.ResultsBovine chondrocytes and fibroblast-like synoviocytes expressed all adenosine receptors. PEMFs evoked an up-regulation of A2A and A3 receptors and thermodynamic parameters indicate that adenosine binding is enthalpy and entropy driven. In PEMF-treated cells the potency of typical A2A or A3 agonists on cyclic AMP assays was significantly increased when compared with the untreated cells. PEMFs potentiated the effect of A2A or A3 agonists on cell proliferation in both cell types.ConclusionsPEMFs mediate an up-regulation of A2A and A3 receptors related to an increase of their functional activities in bovine chondrocytes and fibroblast-like synoviocytes. No differences are present in adenosine affinity and in the drug–receptor interactions. Our data could be used as a trigger to future studies addressed to PEMFs and adenosine therapeutic intervention in inflammatory joint diseases

Pharmacological characterization of P2X1 and P2X3 purinergic receptors in bovine chondrocytes

SummaryObjectiveThe aim of the present study is that of characterizing, for the first time in a quantitative way, from a biochemical, physico chemical and functional point of view P2X1 and P2X3 purinergic receptors in bovine chondrocytes. The affinity and the potency of typical purinergic ligands were studied through competition binding experiments and their role in modulating chondrocyte actvities was investigated by analyzing nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) release.MethodsSaturation, competition binding experiments, western blotting and immunohistochemistry assays on the P2X1 and P2X3 purinergic receptors in bovine chondrocytes were performed. Thermodynamic analysis of the P2X1 and P2X3 purinergic binding was studied to investigate the forces driving drug-receptor coupling. In the functional assays (NO and PGE2 release) the potency of purinergic agonists and antagonists was evaluated.ResultsBovine chondrocytes expressed P2X1 and P2X3 purinergic receptors and thermodynamic parameters indicated that purinergic binding is enthalpy- and entropy-driven for agonists and totally entropy-driven for antagonists. Typical purinergic agonists such as adenosine 5′-triphosphate (ATP) and α,β-methyleneATP were able to increase NO and PGE2 release. A purinergic antagonist, A317491, was able to block the stimulatory effect on functional experiments mediated by the agonists.ConclusionsThese data demonstrate for the first time the presence of functional P2X1 and P2X3 purinergic receptors in bovine chondrocytes. Agonists and antagonists are thermodynamically discriminated and are able to modulate functional responses such as NO and PGE2 release. These results suggest the potential role of novel purinergic antagonists in the treatment of pathophysiological diseases linked to the inflammation and involved in articular cartilage resorption

Progetto ex 60% - I recettori A2A dell'adenosina nelle patologie ereditarie neurodegenerative da poliglutamine

I risultati di questo studio potrebbero avere importanti implicazioni sia per la ricerca di base che per quella applicata. In particolare, l’analisi dello stato del recettore A2A dell’adenosina in pazienti studiati dal punto di vista trasversale e/o longitudinale permetterà di stabilire se esiste una correlazione tra il grado di alterazione del recettore A2A e lo stato clinico della patologia. Questi risultati potrebbero essere alla base per lo sviluppo di un nuovo test diagnostico basato sulla valutazione dello stato del recettore A2A in elementi figurati del sangue facilmente ottenibili da pazienti affetti da malattie neurodegenerative. Inoltre, l’identificazione e l’analisi di specifici biomarkers per una particolare malattia o per un particolare gruppo di malattie che condividono lo stesso tipo di mutazione, potrebbe aiutare nella comprensione dei meccanismi molecolari e patogenetici comuni. Di conseguenza se verranno identificate nuove disfunzioni biologiche associate alle malattie in esame sarà possibile definire un profilo malattia-specifico utile nel monitorare l’efficacia di nuovi trattamenti farmacologici allo scopo di ridurre e/o ritardare la progressione della malattia. Infine, l’identificazione di nuovi biomarkers potrebbe offrire la possibilità di prevedere l’età di insorgenza delle malattie in pazienti asintomatici, la progressione delle malattie in pazienti sintomatici e di monitorare l’efficacia di nuovi trattamenti farmacologici

PRIN 2008 - Caratterizzazione farmacologica e funzionale dei recettori dell'adenosina in cellule U937 e in macrofagi alveolari di pazienti affetti da broncopneumopatia cronica ostruttiva.

Il presente progetto ha come obiettivo la caratterizzazione farmacologica e la delucidazione del ruolo biologico dei recettori adenosinici nella BPCO, un frequentestato patologico caratterizzato da limitazione del flusso respiratorio che rappresenta la quarta causa di morte a livello mondiale. L'infiammazione delle vie aeree è la principale caratteristica patofisiologica della BPCO e coinvolge diverse cellule inclusi i macrofagi che giocano un ruolo fondamentale nella BPCO attraverso il rilascio di mediatori cellulari infiammatori. Infatti, nei pazienti affetti da BPCO, il numero dei macrofagi è marcatamente elevato nel polmone e nello spazio alveolare. Tale aumento potrebbe derivare da un elevato reclutamento dei monociti, dalla loro prolungata sopravvivenza e dalla loro aumentata proliferazione nel polmone. Inoltre, i macrofagi alveolari ottenuti da pazienti con BPCO presentano un'aumentata secrezione di mediatori dell'infiammazione, incluse citochine e chemochine e mostrano l'attivazione del fattore di trascrizione nucleare NF-kB. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi recettoriali adenosinici sono espressi nei monociti e nei macrofagi e che la loro attivazione influenza diverse funzioni cellulari incluse proliferazione, differenziamento, fagocitosi e rilascio dei mediatori dell'infiammazione. Recentemente, è stato riportato che i recettori adenosinici sono differentemente espressi nel parenchima polmonare dei pazienti affetti da BPCO. In particolare, i recettori adenosinici A2A e A3 sono presenti nelle cellule epiteliali bronchiolari e alveolari, nel muscolo liscio bronchiolare e nelle cellule endoteliali. Al contrario, i recettori adenosinici A2B sono localizzati solo nei mastociti e nei macrofagi. Inoltre, è stato osservato che i parametri del binding recettoriale sono alterati nei pazienti con BPCO e che esiste una correlazione significativa tra la densità e l'affinità dei recettori adenosinici e il rapporto tra volume espiratorio forzato in un secondo (FEV1) e la capacità vitale forzata (FVC), un noto indice dell'ostruzione del flusso respiratorio. È da notare che studi immunoistochimici hanno dimostrato che uno dei maggiori siti di espressione di tutti i recettori adenosinici nei pazienti affetti da BPCO è rappresentato dai macrofagi alveolari. Questi risultati indicano il coinvolgimento dei recettori adenosinici nella BPCO e suggeriscono la necessità di meglio caratterizzare codesti recettori da un punto di vista farmacologico e chiarirne il ruolo biologico nella funzionalità dei macrofagi alveolari nella BPCO. Il progetto si focalizzerà sui seguenti aspetti: 1) caratterizzare il pattern di espressione dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B, e A3 nei macrofagi alveolari umani ottenuti da lavaggi broncoalveolari (BAL) di pazienti con un grado di BPCO da medio a moderato in fase stabile comparato con un gruppo di fumatori omogenei per sesso ed età con funzione polmonare normale (gruppo di controllo). In particolare, sarà ottenuta una completa caratterizzazione dei recettori adenosinici sia attraverso l'analisi farmacologica dei parametri del binding (affinità e densità), sia tramite dati di espressione genica e proteica e studi immunocitochimici. Per determinare il numero e l'affinità dei recettori adenosinici, saranno condotti saggi di saturazione del binding usando radioligandi affini e selettivi e sarà effettuata l'analisi di Scatchard. Inoltre, per identificare i sottotipi recettoriali adenosinici saranno effettuati studi immunocitochimici usando anticorpi specifici per ciascun recettore. In seguito, i parametri del binding ai recettori adenosinici saranno comparati con i risultati dell'espressione genica e proteica ottenuti grazie a esperimenti di RT-PCR quantitativa e western blotting. 2) determinare il ruolo funzionale dei recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina nelle colture di macrofagi alveolari derivati da campioni di BAL di pazienti affetti da BPCO e soggetti di controllo. Verrà inoltre studiata la modulazione dell'espressione dei recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina indotta da diversi stimoli come IL-1ß, TNF- , H2O2 e SIN-1. Il rilascio extracellulare di numerosi mediatori infiammatori prima e dopo il trattamento con agonisti e/o antagonisti dei recettori dell'adenosina sarà attentamente verificato. Saranno valutati numerosi mediatori dell'infiammazione potenzialmente coinvolti nella regolazione dell'espressione dei recettori dell'adenosina nei macrofagi alveolari ottenuti dal BAL di pazienti affetti da BPCO confrontati con fumatori con normale funzionalità polmonare. Simili studi ottenuti sulle cellule U937 saranno importanti per identificare le migliori condizioni sperimentali da usare nei macrofagi alveolari umani. 3) valutare la correlazione statistica tra i parametri farmacologici dei recettori adenosinici nei macrofagi alveolari e tra i parametri clinico fisiologici ottenuti dai pazienti esaminati. I macrofagi alveolari deriveranno dal BAL di pazienti con BPCO di grado da medio a moderato in fase stabile comparati con un gruppo di fumatori omogenei per sesso ed età con funzione polmonare normale (gruppo di controllo). In tutti i soggetti, saranno valutati parametri clinici quali la funzionalità polmonare espressa dal rapporto FEV1/FVC noto indice dell'ostruzione del flusso respiratorio (FEV1, volume espiratorio forzato in un secondo; FVC, capacità vitale forzata). 4) determinare l'espressione e il ruolo funzionale dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B, e A3 nella regolazione delle attività dei macrofagi utilizzando un modello in vitro rappresentato da una linea cellulare monocitaria da leucemia U937 non trattata o trattata con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA). Sarà ottenuta una completa caratterizzazione dei recettori adenosinici attraverso l'analisi farmacologica dei parametri del binding (affinità e densità), e tramite dati di espressione genica e proteica. Il coinvolgimento di specifici recettori adenosinici nel modulare le attività macrofagiche sarà studiato sia valutando gli effetti cellulari indotti da agonisti e/o antagonisti altamente potenti e selettivi, sia attraverso il silenziamento di specifici recettori in esperimenti di siRNA, sulla produzione di AMP ciclico, sulla proliferazione cellulare e sul rilascio di mediatori infiammatori. Saranno valutati i livelli di chemochine (ad esempio IL-8, MCP-1), citochine infiammatorie (ad esempio IL6, IL-1ß) e diverse metalloproteasi (ad esempio MMP-1, MMP-9, MMP-12) presenti nel terreno di coltura. È stato riportato che l'adenosina può sopprimere l'attivazione del fattore nucleare kB (NF-kB), un fattore di trascrizione essenziale per l'espressione di diverse proteine correlate all'infiammazione. Inoltre, sarà valutato il coinvolgimento dell'attivazione di NF-kB indotta dai recettori adenosinici. 5) studiare il ruolo di un pannello di mediatori dell'infiammazione nella regolazione dell'espressione dei recettori adenosinici. Studi precedenti hanno dimostrato che citochine infiammatorie come TNF- sono in grado di modulare l'espressione dei recettori adenosinici ed è noto che molti mediatori infiammatori sono comunemente presenti nel microambiente della BPCO. Perciò è possibile ipotizzare che queste molecole possano influenzare l'espressione dei recettori adenosinici. Questa parte del programma è progettata per valutare la modulazione dell'espressione dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B e A3 indotta da stimoli differenti come IL1-ß, TNF- , perossido di idrogeno (H2O2) o un donatore di perossinitrito (SIN-1)

Progetto: Cofin - Responsabile Unità. Il sistema adenosinergico ed il network citochinico nello scompenso cardiaco cronico e nel trapianto di cuore.

La presente ricerca si colloca nel campo della diagnosi e nella terapia delle malattie del sistema cardiovascolare, e riguarda un metodo “in vitro” per monitorare la progressione clinica del danno cardiaco verso lo scompenso emodinamico terminale, e per verificare l’efficacia dei trattamenti farmacologici in grado di prevenire l’insorgenza della malattia o di ritardarne la progressione, ovvero di ripristinare le condizioni emodinamiche. Dallo studio svolto si è osservato che: 1) nelle cellule circolanti di soggetti affetti da scompenso cardiaco terminale si ha un aumento della densità dei recettori A2A, 2) tale comportamento è associato ad una sovrapproduzione di cAMP indotto “in vitro” in queste cellule da composti A2A agonisti, 3) il comportamento anomalo del sistema adenilato cilasi viene efficacemente inibito da composti ad azione A2A antagonista, 4) l’aumento dei recettori A2A nelle cellule circolanti è accompagnato da un analogo incremento del numero di recettori nel cuore di questi pazienti sottoposti a trapianto, 5) nei pazienti cardiotrapiantati la densità recettoriale A2A nelle cellule circolanti ritorna progressivamente alla normalità, in modo parallelo al ripristino del compenso emodinamico. Dunque sia il numero dei recettori A2A periferici (Bmax), sia la capacità degli agonisti A2A di stimolare la produzione di cAMP (EC50), via adenilato ciclasi, possono essere utilizzati come marker biologici per monitorare la progressione della malattia cardiaca ed il ripristino di una normale funzione emodinamica, successiva a trapianto

Progetto Sigma-Tau: Valutazione in vitro della capacità d'interazione di alcune sostanze verso i recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina e successiva valutazione della modulazione dei livelli intracellulari di cAMP

New SIGMA TAU compounds were tested in inhibition binding assays to detect affinity (Ki) to human A1, A2A and A3 adenosine receptors. Moreover cyclic AMP assays were performed to evaluate the capability of these compounds to modulate cAMP levels in the absence and in the presence of typical adenosine agonists in CHO cells transfected with human A1, A2A, A2B and A3 receptor subtypes, respectively

Progetto: Telethon - Unità di Ferrara. Identification of peripheral biological markers of disease in patients with Huntington Disease and other polyglutamine disorders.

Objectives. Here we aim at testing the activity and expression levels of a restricted number of molecules in peripheral blood cells from patients with Huntington Disease (HD). These molecules were chosen because they are affected in cells or mice expressing mutant huntingtin. Other hereditary neurological diseases both associated and non- associated to polyglutamine (Spinocerebellar Ataxias, SCA, and Friedreich Ataxia) will be considered to evaluate whether similar peripheral alterations are present. Background/rationale. HD is part of a group of hereditary late-onset neurodegenerative diseases that share a similar genetic mutation, characterized by an expansion of glutamine tract in specific proteins. Although genetic test can easily assess the presence of the mutation, no other tests are currently available to monitor disease onset and progression. The identification of reliable peripheral indicators of disease would be especially important in clinical therapeutic trials. Recently, members of this network have shown that alterations in A2A receptor profile can be detected both in experimental HD models and also in lymphocytes from HD patients. Description of the project. On these bases, we plan to establish whether the observed adenosine A2A receptor alterations are also present in other polyglutamine disorders, such as SCAs and to verify if the changes correlate with disease progression and clinical severity: In addition, we will study a group of other biological indicators, including endocannabinoid receptors (CB1and non-CB1), brain-derived-neurotrophic factor (BDNF) mRNA and protein levels, mRNA levels of cholesterol enzyme biosynthetic pathway, in blood of HD and SCA patients. Anticipated output. To make available informative peripheral biomarkers that may implement clinical monitoring of disease progression in future clinical trials evaluating the efficacy of potential therapeutic interventions

Il sistema recettoriale dell'adenosina come biomarker di patologie.

Il gruppo proponente ha una documentata competenza nello studio delle forze molecolari che guidano l’accoppiamento farmaco-recettore con particolare riguardo ai fattori fisico-chimici determinanti l’affinità di legame e l’attività intrinseca di ligandi recettoriali. Ha inoltre una notevole esperienza nella caratterizzazione biochimica e funzionale dei recettori negli elementi figurati del sangue. Numerose ricerche sono state condotte per studiare eventuali alterazioni recettoriali in diverse patologie quali l’ipertensione essenziale, lo scompenso cardiaco, le malattie neurodegenerative, la broncopneumopatia cronica ostruttiva ed alcune neoplasie. A titolo esemplificativo è stato dimostrato la presenza di una aberrante alterazione dei recettori A2A dell’adenosina in pazienti affetti da Corea di Huntington. Inoltre, è stato verificato che nelle cellule di melanoma umano l’adenosina è in grado di aumentare l’espressione della proteina HIF1-alfa e che l’effetto è mediato dal recettore A3 dell’adenosina. Questi recettori sono stati analizzati anche in pazienti affetti da tumore colon rettale e sono state dimostrate alterazioni a livello della densità recettoriale periferica che si normalizzano dopo l’intervento chirurgico

FAR 2009- Il sistema recettoriale dell'adenosina come biomarker di patologie

Il gruppo proponente ha una documentata competenza nelle prime fasi dello sviluppo pre-clinico dei farmaci determinando le forze molecolari che guidano l’accoppiamento farmaco-recettore e selezionando ligandi recettoriali con ottima affinità di legame ed attività intrinseca. Il gruppo ha anche una notevole esperienza in campo molecolare con particolare riguardo ai meccanismi di trasduzione del segnale a livello cellulare. Inoltre ha esperienza nella caratterizzazione molecolare, biochimica e farmacologica dei recettori negli elementi figurati del sangue dove sono state evidenziate alterazioni recettoriali in patologie quali l’ipertensione essenziale, lo scompenso cardiaco, le malattie neurodegenerative (Corea di Huntington, Malattia di Parkinson), la broncopneumopatia cronica ostruttiva, le malattie croniche infiammatorie ed alcune neoplasie. Ad esempio in diversi modelli di tumore l’adenosina tramite il recettore A3 è in grado di aumentare l’espressione del fattore di trascrizione HIF1-alfa. Inoltre, in pazienti affetti da tumore colon rettale è stata dimostrata la presenza di una alterazione della densità del recettore A3 che si normalizza dopo l’intervento chirurgico

Progetto: FIRB2003 Unità di Ferrara. Sviluppo ed applicazione di tecnologie altamente innovative ed efficienti per la sintesi di nuove molecole con dimostrazione della loro attività biologica su proteine di membrana implicate nel danno cerebrale

L’Unità Ferrara 1 si propone di caratterizzare dal punto di vista farmacologico e biochimico ligandi di nuova sintesi per i recettori di membrana attraverso i seguenti aspetti sperimentali: a) La prima parte del progetto sarà finalizzata, mediante saggi di “binding”, utilizzando radioligandi altamente selettivi, a condurre un’analisi sistematica dei recettori espressi su tessuti nativi di animali da esperimento e in cellule trasfettate con recettori umani. Gli esperimenti di saturazione saranno condotti utilizzando 8-10 concentrazioni crescenti di radioligandi altamente affini e selettivi per il recettore in esame. Gli esperimenti di inibizione saranno effettuati utilizzando 6-8 concentrazioni di ciascuno dei nuovi ligandi sintetizzati dalle Unità che compartecipano a questo progetto di ricerca. In particolare saranno condotti esperimenti di inibizione del “binding” a diverse temperature nell’intervallo 0-37°C allo scopo di verificare come varia l’affinità dei nuovi composti in funzione della temperatura (Varani et al., 2000). Il tempo di incubazione sarà opportunamente stabilito ad ogni temperatura grazie a specifici esperimenti di cinetica del binding recettoriale. Il radioligando libero sarà separato da quello legato mediante una filtrazione rapida sottovuoto attraverso filtri a fibra di vetro con un apparato di filtrazione Brandel. La radioattività trattenuta dai filtri sarà determinata mediante uno scintillatore Beckman Tri Carb 2500 (efficienza del 57%). I risultati sperimentali ottenuti saranno utilizzati per valutare i parametri termodinamici quali energia libera, entropia ed entalpia (Borea et al., 2000). b) La seconda fase sarà dedicata a correlare i dati di “binding” con alcuni eventi post-recettoriali. A questo proposito sarà determinata la funzionalità delle proteine G accoppiate con i recettori in esame misurando la capacità di stimolare il legame di [35S]-GTPgammaS (Gessi et al., 1999). c) Per quanto riguarda il sistema effettore saranno misurati i livelli di cAMP stimolati da forskolin valutando l’effetto di nuovi composti sulla produzione di cAMP. Le cellule in esame saranno risospese in un opportuno tampone e preincubate per 10 minuti in un bagno termostatato a 37°C. Saranno testati i nuovi ligandi sintetizzati a concentrazioni crescenti e tenuti in incubazione per 10 minuti. La reazione terminerà aggiungendo una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 6%. La soluzione finale ottenuta dopo centrifugazione sarà testata per determinare i livelli di cAMP seguendo il metodo descritto da Varani et al. 2003. d) Inoltre, dal momento che le concentrazioni di calcio sono critiche nel mantenere i livelli di attività di molti processi intracellulari, saranno condotti esperimenti per misurare i cambiamenti di questo importante secondo messaggero tramite un indicatore fluorescente FURA 2/AM. In particolare sarà studiato l’effetto di particolari mutazioni nel dominio extracellulare o nella regione intracitoplasmatica del recettore P2X7 sui meccanismi di trasduzione del segnale e sulla produzione dei secondi messaggeri (Ferrari et al., 2000). e) Infine gli effetti del segnale mediato dal calcio intracellulare sarà studiato usando approcci tipicamente molecolari. A questo scopo si utilizzeranno l’impiego del clonaggio in vettori di espressione e per siRNA specifici, trasfezione e trasduzione di linee cellulari tessuto specifiche, RT-PCR Real Time, espressione genica, tecniche di immunocitochimica, misurazioni del calcio subcellulare e saggi di legame al DNA da parte di fattori trascrizionali attivati dal calcio (Aguiari et al., 2003). Aguiari G et al, Biochem Biophys Res Commun, 301, 657-664, 2003. Ferrari D et al, FASEB J, 14, 2466-2476, 2000. Borea PA et al, Biochem Pharmacol, 11, 1549-1556, 2000. Gessi S et al, Life Sci, 64, 1403-1413, 1999. Varani K et al, Mol Pharmacol, 57, 968-975, 2000. Varani K et al, FASEB J, 17, 2148-2150, 2003