PRIN 2008 - Caratterizzazione farmacologica e funzionale dei recettori dell'adenosina in cellule U937 e in macrofagi alveolari di pazienti affetti da broncopneumopatia cronica ostruttiva.

Abstract

Il presente progetto ha come obiettivo la caratterizzazione farmacologica e la delucidazione del ruolo biologico dei recettori adenosinici nella BPCO, un frequentestato patologico caratterizzato da limitazione del flusso respiratorio che rappresenta la quarta causa di morte a livello mondiale. L'infiammazione delle vie aeree è la principale caratteristica patofisiologica della BPCO e coinvolge diverse cellule inclusi i macrofagi che giocano un ruolo fondamentale nella BPCO attraverso il rilascio di mediatori cellulari infiammatori. Infatti, nei pazienti affetti da BPCO, il numero dei macrofagi è marcatamente elevato nel polmone e nello spazio alveolare. Tale aumento potrebbe derivare da un elevato reclutamento dei monociti, dalla loro prolungata sopravvivenza e dalla loro aumentata proliferazione nel polmone. Inoltre, i macrofagi alveolari ottenuti da pazienti con BPCO presentano un'aumentata secrezione di mediatori dell'infiammazione, incluse citochine e chemochine e mostrano l'attivazione del fattore di trascrizione nucleare NF-kB. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi recettoriali adenosinici sono espressi nei monociti e nei macrofagi e che la loro attivazione influenza diverse funzioni cellulari incluse proliferazione, differenziamento, fagocitosi e rilascio dei mediatori dell'infiammazione. Recentemente, è stato riportato che i recettori adenosinici sono differentemente espressi nel parenchima polmonare dei pazienti affetti da BPCO. In particolare, i recettori adenosinici A2A e A3 sono presenti nelle cellule epiteliali bronchiolari e alveolari, nel muscolo liscio bronchiolare e nelle cellule endoteliali. Al contrario, i recettori adenosinici A2B sono localizzati solo nei mastociti e nei macrofagi. Inoltre, è stato osservato che i parametri del binding recettoriale sono alterati nei pazienti con BPCO e che esiste una correlazione significativa tra la densità e l'affinità dei recettori adenosinici e il rapporto tra volume espiratorio forzato in un secondo (FEV1) e la capacità vitale forzata (FVC), un noto indice dell'ostruzione del flusso respiratorio. È da notare che studi immunoistochimici hanno dimostrato che uno dei maggiori siti di espressione di tutti i recettori adenosinici nei pazienti affetti da BPCO è rappresentato dai macrofagi alveolari. Questi risultati indicano il coinvolgimento dei recettori adenosinici nella BPCO e suggeriscono la necessità di meglio caratterizzare codesti recettori da un punto di vista farmacologico e chiarirne il ruolo biologico nella funzionalità dei macrofagi alveolari nella BPCO. Il progetto si focalizzerà sui seguenti aspetti: 1) caratterizzare il pattern di espressione dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B, e A3 nei macrofagi alveolari umani ottenuti da lavaggi broncoalveolari (BAL) di pazienti con un grado di BPCO da medio a moderato in fase stabile comparato con un gruppo di fumatori omogenei per sesso ed età con funzione polmonare normale (gruppo di controllo). In particolare, sarà ottenuta una completa caratterizzazione dei recettori adenosinici sia attraverso l'analisi farmacologica dei parametri del binding (affinità e densità), sia tramite dati di espressione genica e proteica e studi immunocitochimici. Per determinare il numero e l'affinità dei recettori adenosinici, saranno condotti saggi di saturazione del binding usando radioligandi affini e selettivi e sarà effettuata l'analisi di Scatchard. Inoltre, per identificare i sottotipi recettoriali adenosinici saranno effettuati studi immunocitochimici usando anticorpi specifici per ciascun recettore. In seguito, i parametri del binding ai recettori adenosinici saranno comparati con i risultati dell'espressione genica e proteica ottenuti grazie a esperimenti di RT-PCR quantitativa e western blotting. 2) determinare il ruolo funzionale dei recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina nelle colture di macrofagi alveolari derivati da campioni di BAL di pazienti affetti da BPCO e soggetti di controllo. Verrà inoltre studiata la modulazione dell'espressione dei recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina indotta da diversi stimoli come IL-1ß, TNF- , H2O2 e SIN-1. Il rilascio extracellulare di numerosi mediatori infiammatori prima e dopo il trattamento con agonisti e/o antagonisti dei recettori dell'adenosina sarà attentamente verificato. Saranno valutati numerosi mediatori dell'infiammazione potenzialmente coinvolti nella regolazione dell'espressione dei recettori dell'adenosina nei macrofagi alveolari ottenuti dal BAL di pazienti affetti da BPCO confrontati con fumatori con normale funzionalità polmonare. Simili studi ottenuti sulle cellule U937 saranno importanti per identificare le migliori condizioni sperimentali da usare nei macrofagi alveolari umani. 3) valutare la correlazione statistica tra i parametri farmacologici dei recettori adenosinici nei macrofagi alveolari e tra i parametri clinico fisiologici ottenuti dai pazienti esaminati. I macrofagi alveolari deriveranno dal BAL di pazienti con BPCO di grado da medio a moderato in fase stabile comparati con un gruppo di fumatori omogenei per sesso ed età con funzione polmonare normale (gruppo di controllo). In tutti i soggetti, saranno valutati parametri clinici quali la funzionalità polmonare espressa dal rapporto FEV1/FVC noto indice dell'ostruzione del flusso respiratorio (FEV1, volume espiratorio forzato in un secondo; FVC, capacità vitale forzata). 4) determinare l'espressione e il ruolo funzionale dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B, e A3 nella regolazione delle attività dei macrofagi utilizzando un modello in vitro rappresentato da una linea cellulare monocitaria da leucemia U937 non trattata o trattata con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA). Sarà ottenuta una completa caratterizzazione dei recettori adenosinici attraverso l'analisi farmacologica dei parametri del binding (affinità e densità), e tramite dati di espressione genica e proteica. Il coinvolgimento di specifici recettori adenosinici nel modulare le attività macrofagiche sarà studiato sia valutando gli effetti cellulari indotti da agonisti e/o antagonisti altamente potenti e selettivi, sia attraverso il silenziamento di specifici recettori in esperimenti di siRNA, sulla produzione di AMP ciclico, sulla proliferazione cellulare e sul rilascio di mediatori infiammatori. Saranno valutati i livelli di chemochine (ad esempio IL-8, MCP-1), citochine infiammatorie (ad esempio IL6, IL-1ß) e diverse metalloproteasi (ad esempio MMP-1, MMP-9, MMP-12) presenti nel terreno di coltura. È stato riportato che l'adenosina può sopprimere l'attivazione del fattore nucleare kB (NF-kB), un fattore di trascrizione essenziale per l'espressione di diverse proteine correlate all'infiammazione. Inoltre, sarà valutato il coinvolgimento dell'attivazione di NF-kB indotta dai recettori adenosinici. 5) studiare il ruolo di un pannello di mediatori dell'infiammazione nella regolazione dell'espressione dei recettori adenosinici. Studi precedenti hanno dimostrato che citochine infiammatorie come TNF- sono in grado di modulare l'espressione dei recettori adenosinici ed è noto che molti mediatori infiammatori sono comunemente presenti nel microambiente della BPCO. Perciò è possibile ipotizzare che queste molecole possano influenzare l'espressione dei recettori adenosinici. Questa parte del programma è progettata per valutare la modulazione dell'espressione dei recettori adenosinici A1, A2A, A2B e A3 indotta da stimoli differenti come IL1-ß, TNF- , perossido di idrogeno (H2O2) o un donatore di perossinitrito (SIN-1)