Human In Vitro Vascularization, Adipocytes and Vascularized Adipose Tissue : Three relevant models for studies of vascularization, adipocytes and their interaction

Rasvakudos on verisuonitettu endokriininen kudos. Kasvavan liikalihavuusepidemian takia rasvakudoksen toiminnan ja aineenvaihdunnan sekä näiden häiriötilojen tutkiminen ja rasvakudokseen vaikuttavien aineiden tunnistaminen on noussut entistä tärkeämmäksi tutkimusaiheeksi. Verisuonituksen ja rasvakudoksen toimintaan ja määrään pyritään tietoisesti vaikuttamaan lääkkeillä. Lääkkeiden toiminta täytyy osoittaa ennen kuin lääkkeet päätyvät markkinoille. Elinympäristössä on myös kemikaaleja, joiden vaikutuksia rasvakudokseen ei ole tiedostettu. On tärkeää tunnistaa nämä obesogeenit sillä ne ovat erityisen haitallisia sikiöille ja kehittyville lapsille. Jotta nämä voidaan tunnistaa, tarvitaan luotettavia testisysteemejä. Rasvakudokseen liittyvät tutkimukset tehdään kuitenkin edelleen useimmiten eläimillä tai eläinsoluilla. Lajien väliset erot rasvakudoksen säätelyssä ovat kuitenkin huomattavia ja siksi tarvitaan solumalleja, jotka kuvaavat ihmisen biologiaa. Tässä tutkimuksessa kehitettiin verisuonitettu rasvakudosmalli ihmisen soluista. Tutkimuksessa kehitettiin ensin erillään mahdollisimman luonnollisen kaltaiset in vitro verisuonet ja rasvasolut, jonka jälkeen nämä yhdistettiin verisuonitetuksi rasvakudokseksi. Verisuonten muodostumista varten kehitettiin seerumiton kasvatusliuos rasvan stroomasolujen ja napanuoran endoteelisolujen yhteisviljelmässä käytettäväksi (angiogeneesimalli). Seuraavaksi kehitettiin protokolla insuliiniherkkien rasvasolujen erilaistamiseksi rasvan stroomasoluista. Kolmannessa vaiheessa verisuonitus yhdistettiin rasvasoluihin yksinkertaisia menetelmiä käyttäen, jotta saatiin selville sopiva viljelyaika mallille, solujen siirrostusajankohta sekä erilaistuksen aikaansaavien kasvatusliuosten lisäysjärjestys verisuonitetun rasvamallin aikaansaamiseksi. Näitä parhaiksi havaittuja viljelyolosuhteita hyväksi käyttäen yhdistettiin luonnollisen kaltaiset verisuonet ja rasvasolut verisuonitetuksi rasvamalliksi. Tämän mallin ominaisuudet ja vaste kemikaaleille, myös insuliinille, tutkittiin ja varmistettiin, että malli ja sen toiminta ovat luonnollisen rasvakudoksen kaltaisia. Tulokset osoittivat, että angiogeneesimalliin muodostui hyvä verisuoniverkosto, jossa suonissa oli endoteelikerros jota ympäröi tyvikalvo. Suonet olivat kolmiulotteisia putkia, joissa oli lumen ja soluväliaine ja perisyytit ympäröivät näitä suonia. Rasvasolut keräsivät rasvaa, ilmensivät kypsän rasvasolun geenejä ja reagoivat insuliiniin lipolyysin estymisellä ja glukoosin sisäänotolla. Verisuonitetussa rasvakudosmallissa olevat suonet olivat luonnollisten suonien kaltaisia, rasvasolut olivat edelleen kypsiä rasvasoluja ja malli reagoi insuliinille oikein. Verisuonituksen vaikutus rasvasoluihin nähtiin rasvasolujen nopeampana kypsymisenä ja parantuneena insuliiniherkkyytenä. Verisuonten nähtiin myös vaikuttavan kemikaalivasteisiin mallissa. Kaikki kolme mallia, verisuonet, rasvasolut ja verisuonitettu rasva ovat itsenäisesti käytettäväksi soveltuvia malleja angiogeneesin ja adipogeneesin tutkimiseen. Verisuonitettua rasvakudosmallia voidaan käyttää laajasti rasvakudoksen tutkimiseen mm. toksikologian, lääkekehityksen ja solubiologian aloilla.Adipose tissue is a highly vascularized endocrine tissue. Due to the ever growing problem of obesity, the interest in determining mechanisms behind adipose tissue imbalances and identifying substances causing metabolic disturbances in adipose tissue is increasing. There are several drug treatments targeting vasculature and/or adipose tissue currently available and constantly new ones being developed including cancer, eye condition, insulin sensitizing and obesity treatments. Hence drug development needs reliable and relevant models for development and testing of these treatments. In addition, more attention has been focused on chemicals in our living environment that inadvertently affect adipose tissue. These obesogens need to be identified as they are especially harmful to fetuses and children. In order to identify these, relevant test systems are needed. Most adipose tissue related research is still conducted on animals or animal cells. Due to the species-to-species differences in adipose tissue regulation, cell models depicting human biology are greatly needed. The aim of this study was to develop an in vitro vascularized adipose tissue model. A bottom-up approach was utilized, first optimizing the building blocks for the model and then moving on to combining these components. First, serum-free induction medium was developed for induction of in vitro vascularization (i.e. angiogenesis model) in human adipose stromal cells (hASC) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) co-cultures. Second, a protocol for inducing insulin sensitive adipocytes from hASC was developed. In the third step, vasculature and adipocytes were combined using simplified induction protocols to provide a proof of concept model of vascularized adipose tissue and to determine the optimal culture time, timing of induction media, and timing of seeding of hASC and HUVEC. Finally, we combined the two optimal components, insulin sensitive adipocyte protocol and vasculature utilizing the culture set-ups that were found to be optimal for creating the vascularized adipose tissue model. We studied the predictivity of this model by exposing it to chemicals, including insulin, with known effects on adipose tissue, and compared responses to those found in literature. Results showed that the angiogenesis model induced with this serum-free medium produced an extensive vascular network with morphology resembling vessels in vivo including the intact endothelial layer, basement membrane, 3D tubules with lumen, extracellular matrix proteins and surrounding pericytes. The adipocytes differentiated from hASC with the new protocol accumulated lipids, showed mature adipocytes markers and responded to insulin by lipolysis inhibition and glucose uptake. The vascularized adipose tissue model contained an in vivo-like vascular network and mature adipocytes that were responsive to insulin. The interaction of adipocytes with vascularization was seen to result in faster maturation of adipocytes and better insulin sensitivity. Also the impact of chemicals on vascularized adipose tissue was different than on adipocytes alone. The angiogenesis model with serum-free induction and the insulin sensitive adipocyte model are relevant in vitro models that can be used independently for studying angiogenesis and adipogenesis. The combined model, vascularized adipose tissue model, is a useful tool for adipose tissue research, including toxicological, drug discovery and cell biology research applications

GENE EXPRESSION PROFILING AFTER ANGIOGENESIS INHIBITOR TREATMENT

The angiogenic process can be summarized as cell activation by a lack of oxygen releases angiogenic molecules that attract inflammatory and endothelial cells and promote their proliferation. Several protein fragments produced by the digestion of the blood-vessel walls intensify the proliferative activity of endothelial cells. Acetyl salicylic acid is often used as an analgesic drug to relieve minor aches and pains, a drug with antitumour activity and an anti-inflammatory medication. In our experiments we propose using the angiogenesis model and photodynamic therapy (PDT) for observing changes in angiogenesis after treatment, and also for increasing the effect of PDT by addition of angiogenesis inhibitors

THE EFFECT OF ACETYLSALICYLIC ACID ON ANGIOGENESIS IN VITRO

Angiogenesis, the formation of new blood vessels, is an essential aspect of, among others, embryonic development, wound healing and the female reproductive cycle. It is also necessary for the expansion of tumour masses beyond a minute volume. Acetylsalicylic acid (ASA) is a non-steroidal anti-inflammatory drug with additional antitumour activity. We tested ASA for its ability to inhibit angiogenesis in a simplified angiogenesis model, hASC+HUVEC co cultured in vitro, using immunocytochemical staining with fluorescence-marked antibodies and observation of tubulelike structures and their branching under a fluorescence microscope. We confirmed that ASA is an efficient and useful angiogenesis inhibitor and deserves further attention. We intend using the designed angiogenesis model and the methods described for observing changes in angiogenesis after anti tumour photodynamic therapy (PDT), and also for enhancing PDT efficiency by addition of angiogenesis inhibitors

Association between [Ga-68]NODAGA-RGDyK uptake and dynamics of angiogenesis in a human cell-based 3D model

Radiolabeled RGD peptides targeting expression of alpha(v)beta(3) integrin have been applied to in vivo imaging of angiogenesis. However, there is a need for more information on the quantitative relationships between RGD peptide uptake and the dynamics of angiogenesis. In this study, we sought to measure the binding of [Ga-68]NODAGA-RGDyK to alpha(v)beta(3) integrin in a human cell-based three-dimensional (3D) in vitro model of angiogenesis, and to compare the level of binding with the amount of angiogenesis. Experiments were conducted using a human cell-based 3D model of angiogenesis consisting of co-culture of human adipose stem cells (hASCs) and of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Angiogenesis was induced with four concentrations (25%, 50%, 75%, and 100%) of growth factor cocktail resulting in a gradual increase in the density of the tubule network. Cultures were incubated with [Ga-68]NODAGA-RGDyK for 90 min at 37 degrees C, and binding of radioactivity was measured by gamma counting and digital autoradiography. The results revealed that tracer binding increased gradually with neovasculature density. In comparison with vessels induced with a growth factor concentration of 25%, the uptake of [Ga-68]NODAGA-RGDyK was higher at concentrations of 75% and 100%, and correlated with the amount of neovasculature, as determined by visual evaluation of histological staining. Uptake of [Ga-68]NODAGA-RGDyK closely reflected the amount of angiogenesis in an in vitro 3D model of angiogenesis. These results support further evaluation of RGD-based approaches for targeted imaging of angiogenesis

Human Adipose Stromal Cell Angiogenesis Assay: Development of Stimulation Medium and Set-up of Cell Characterization

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet Angiogeneesi eli uusien verisuonien muodostus on keskeistä monissa sairauksissa kuten syövässä, silmäsairauksissa ja reumassa. Lisäksi se on sikiönkehityksen avaintapahtumia. Tästä syystä kemikaalien aiheuttamat muutokset verisuonten muodostukseen voivat olla joko on erittäin haitallisia ja positiivisia. Angiogeneesimalli on siis erittäin tarpeellinen lääkeainekehityksessä ja yleisessä kemikaalin haitallisuusarvioinneissa. Tutkimuksen tavoitteena oli löytää kasvatusliuos, jolla aikaan saadaan (ihmisen) rasvan kantasoluihin pohjautuvan angiogeneesimallin verisuonten muodostus sekä pystyttää solujen karakterisointia varten virtaussytometrinen menetelmä. Tutkimusmenetelmät Tutkimuksessa mallinnettiin verisuonten muodostusta viljelemällä rasvan kantasoluja ja napanuoralaskimon endoteelisoluja yhteisviljelmässä 6-13 päivää. Tutkimuksessa testattiin erilaisia kasvatusliuoksia, jotka sisälsivät eri kasvutekijöitä, ravinteita ja seerumin pitoisuuksia. Soluviljelmät värjättiin useilla vasta-aineilla (von Willebrand tekijä, kollageeni IV, CD144, kalponiini, sileälihasmyosiini ja -aktiini).Viljelmiä tutkittiin käänteis- ja konfokaalimikroskoopilla sekä soluanalyysilaitteella (Cell IQ). Verisuonenmuodostusta arvioitiin manuaalisesti sekä automatisoiduilla analyysimenetelmillä. Kontrollina toimi tähän asti käytetty kaupallinen endoteelien kasvatusliuos (EGM-2). Virtaussytometrinen menetelmä optimoitiin ja testattiin. Tätä varten solut käsiteltiin CD144, CD309, CD73, eNOS ja VWF-A2:ään sitoutuvilla vasta-aineilla. Analysointiin käytettiin FACSCanto II (BD) -virtaussytometriä ja FACSDiva -ohjelmaa. Tutkimustulokset Tutkimuksissa havaittiin että kantasoluangiogeneesimalli tuotti tasaisen kolmiulotteisen toistettavan verisuonituksen parhaiten seerumittomassa ympäristössä. Paras verisuonimuodostus havaittiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi DMEM/F12, BSA, L-glutamiini, T3, natriumpyruvaatti, ITS, VEGF, FGF-β, hydrokortisoni ja askorbiinihappo (C-vitamiini). Näistä välttämättömiä olivat VEGF ja FGF-β ja lisäksi askorbiinihappon (200-350 μg/ml) ja hydrokortisonin (0,2-1 μg/ml) lisääminen paransi verisuonten muodostusta. Virtaussytometriassa rasvan kantasolut havaittiin positiivisiksi CD73:n suhteen ja endoteelit CD144, CD309, VWF-A2, CD73 ja eNOS positiivisiksi. Johtopäätökset Tutkimuksissa kehitettiin uusi osakomponenteiltaan tarkasti tunnettu stimulaatiokasvatusliuos korvaamaan kaupallinen EGM-2-kasvatusliuos. Tätä voidaan tulosten pohjalta muokata paremmin esimerkiksi kolmansille soluille sopivaksi stimulointiympäristöksi. Solujen karakterisointi todisti endoteelien tuottavan niille ominaisia proteiineja sekä rasvan kantasolujen kantasolumarkkeria CD7

Human Adipose Stromal Cell Angiogenesis Assay: Development of Stimulation Medium and Set-up of Cell Characterization

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet Angiogeneesi eli uusien verisuonien muodostus on keskeistä monissa sairauksissa kuten syövässä, silmäsairauksissa ja reumassa. Lisäksi se on sikiönkehityksen avaintapahtumia. Tästä syystä kemikaalien aiheuttamat muutokset verisuonten muodostukseen voivat olla joko on erittäin haitallisia ja positiivisia. Angiogeneesimalli on siis erittäin tarpeellinen lääkeainekehityksessä ja yleisessä kemikaalin haitallisuusarvioinneissa. Tutkimuksen tavoitteena oli löytää kasvatusliuos, jolla aikaan saadaan (ihmisen) rasvan kantasoluihin pohjautuvan angiogeneesimallin verisuonten muodostus sekä pystyttää solujen karakterisointia varten virtaussytometrinen menetelmä. Tutkimusmenetelmät Tutkimuksessa mallinnettiin verisuonten muodostusta viljelemällä rasvan kantasoluja ja napanuoralaskimon endoteelisoluja yhteisviljelmässä 6-13 päivää. Tutkimuksessa testattiin erilaisia kasvatusliuoksia, jotka sisälsivät eri kasvutekijöitä, ravinteita ja seerumin pitoisuuksia. Soluviljelmät värjättiin useilla vasta-aineilla (von Willebrand tekijä, kollageeni IV, CD144, kalponiini, sileälihasmyosiini ja -aktiini).Viljelmiä tutkittiin käänteis- ja konfokaalimikroskoopilla sekä soluanalyysilaitteella (Cell IQ). Verisuonenmuodostusta arvioitiin manuaalisesti sekä automatisoiduilla analyysimenetelmillä. Kontrollina toimi tähän asti käytetty kaupallinen endoteelien kasvatusliuos (EGM-2). Virtaussytometrinen menetelmä optimoitiin ja testattiin. Tätä varten solut käsiteltiin CD144, CD309, CD73, eNOS ja VWF-A2:ään sitoutuvilla vasta-aineilla. Analysointiin käytettiin FACSCanto II (BD) -virtaussytometriä ja FACSDiva -ohjelmaa. Tutkimustulokset Tutkimuksissa havaittiin että kantasoluangiogeneesimalli tuotti tasaisen kolmiulotteisen toistettavan verisuonituksen parhaiten seerumittomassa ympäristössä. Paras verisuonimuodostus havaittiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi DMEM/F12, BSA, L-glutamiini, T3, natriumpyruvaatti, ITS, VEGF, FGF-β, hydrokortisoni ja askorbiinihappo (C-vitamiini). Näistä välttämättömiä olivat VEGF ja FGF-β ja lisäksi askorbiinihappon (200-350 μg/ml) ja hydrokortisonin (0,2-1 μg/ml) lisääminen paransi verisuonten muodostusta. Virtaussytometriassa rasvan kantasolut havaittiin positiivisiksi CD73:n suhteen ja endoteelit CD144, CD309, VWF-A2, CD73 ja eNOS positiivisiksi. Johtopäätökset Tutkimuksissa kehitettiin uusi osakomponenteiltaan tarkasti tunnettu stimulaatiokasvatusliuos korvaamaan kaupallinen EGM-2-kasvatusliuos. Tätä voidaan tulosten pohjalta muokata paremmin esimerkiksi kolmansille soluille sopivaksi stimulointiympäristöksi. Solujen karakterisointi todisti endoteelien tuottavan niille ominaisia proteiineja sekä rasvan kantasolujen kantasolumarkkeria CD7

Differentiation of human adipose stromal cells in vitro into insulin-sensitive adipocytes

Adipose tissue-related diseases such as obesity and type 2 diabetes are worldwide epidemics. In order to develop adipose tissue cultures in vitro that mimic more faithfully the in vivo physiology, new well-characterized and publicly accepted differentiation methods of human adipose stem cells are needed. The aims of this study are (1) to improve the existing natural adipose tissue extract (ATE)-based induction method and (2) to study the effects of a differentiation method on insulin responsiveness of the resulting adipocytes. Different induction media were applied on human adipose stromal cell (hASC) monocultures to study the differentiation capacity of the induction media and the functionality of the differentiated adipocytes. Cells were differentiated for 14 days to assess triglyceride accumulation per cell and adipocyte-specific gene expression (PPAR gamma, adiponectin, AP2, leptin, Glut4, Prdm16, CIDEA, PGC1-alpha, RIP140, UCP and ADCY5). Insulin response was studied by measuring glucose uptake and inhibition of lipolysis after incubation with 100 or 500 nM insulin. The selected differentiation method included a 3-day induction with ATE, 6 days in serum-free medium supplemented with 1.15 mu M insulin and 9.06 mu M Troglitazone, followed by 4 days in a defined serum- and insulin-free stimulation medium. This protocol induced prominent general adipocyte gene expression, including markers for both brown and white adipocytes and triglyceride accumulation. Moreover, the cells were sensitive to insulin as observed from increased glucose uptake and inhibition of lipolysis. This differentiation protocol provides a promising approach for the induction of hASC adipogenesis to obtain functional and mature human adipocytes.Peer reviewe