Varicella-Zoster Virus IE4 Protein Interacts with SR Proteins and Exports mRNAs through the TAP/NXF1 Pathway

Available data suggest that the Varicella-Zoster virus (VZV) IE4 protein acts as an important regulator on VZV and cellular genes expression and could exert its functions at post-transcriptional level. However, the molecular mechanisms supported by this protein are not yet fully characterized. In the present study, we have attempted to clarify this IE4-mediated gene regulation and identify some cellular partners of IE4. By yeast two-hybrid and immunoprecipitation analysis, we showed that IE4 interacts with three shuttling SR proteins, namely ASF/SF2, 9G8 and SRp20. We positioned the binding domain in the IE4 RbRc region and we showed that these interactions are not bridged by RNA. We demonstrated also that IE4 strongly interacts with the main SR protein kinase, SRPK1, and is phosphorylated in in vitro kinase assay on residue Ser-136 contained in the Rb domain. By Northwestern analysis, we showed that IE4 is able to bind RNA through its arginine-rich region and in immunoprecipitation experiments the presence of RNA stabilizes complexes containing IE4 and the cellular export factors TAP/NXF1 and Aly/REF since the interactions are RNase-sensitive. Finally, we determined that IE4 influences the export of reporter mRNAs and clearly showed, by TAP/NXF1 knockdown, that VZV infection requires the TAP/NXF1 export pathway to express some viral transcripts. We thus highlighted a new example of viral mRNA export factor and proposed a model of IE4-mediated viral mRNAs export

The Varicella-Zoster Virus ORF47 Kinase Interferes with Host Innate Immune Response by Inhibiting the Activation of IRF3

The innate immune response constitutes the first line of host defence that limits viral spread and plays an important role in the activation of adaptive immune response. Viral components are recognized by specific host pathogen recognition receptors triggering the activation of IRF3. IRF3, along with NF-κB, is a key regulator of IFN-β expression. Until now, the role of IRF3 in the activation of the innate immune response during Varicella-Zoster Virus (VZV) infection has been poorly studied. In this work, we demonstrated for the first time that VZV rapidly induces an atypical phosphorylation of IRF3 that is inhibitory since it prevents subsequent IRF3 homodimerization and induction of target genes. Using a mutant virus unable to express the viral kinase ORF47p, we demonstrated that (i) IRF3 slower-migrating form disappears; (ii) IRF3 is phosphorylated on serine 396 again and recovers the ability to form homodimers; (iii) amounts of IRF3 target genes such as IFN-β and ISG15 mRNA are greater than in cells infected with the wild-type virus; and (iv) IRF3 physically interacts with ORF47p. These data led us to hypothesize that the viral kinase ORF47p is involved in the atypical phosphorylation of IRF3 during VZV infection, which prevents its homodimerization and subsequent induction of target genes such as IFN-β and ISG15

Caractérisation de la régulation post-transcriptionnelle par la protéine IE4 du virus de la Varicelle et du Zona (VZV)

Dans les cellules eucaryotes, l’export des ARN messagers du noyau vers le cytoplasme est un processus complexe et régulé. Les messagers matures sont transportés par le récepteur d’export TAP/NXF1, qui est recruté au niveau des messagers par différents adaptateurs comme les protéines Aly/REF, UAP56 et les protéines SR. Dans le cadre d’une infection virale, en plus des messagers cellulaires, de nombreux messagers viraux doivent être transportés efficacement dans le cytoplasme pour y être traduits. Il est maintenant établi que les herpesvirus codent pour une famille conservée de gènes dont les produits agissent en tant que facteurs d’export et régulent le transport des transcrits viraux. Cette famille inclut la protéine IE4 du virus de la Varicelle et du Zona (VZV). Les principales caractéristiques de ces facteurs d’export viraux sont leur capacité à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme, leur domaine de liaison à l’ARN, et leur capacité à interagir avec des facteurs intervenant dans l’export des messagers cellulaires. Avant cette étude, les données montraient que la protéine IE4 agit comme un régulateur important de l’expression des gènes viraux et cellulaires, mais les mécanismes impliqués n’étaient pas clairement définis. Dans ce travail, nous avons identifié de nouveaux partenaires cellulaires de la protéine IE4, et, bienque des différences existent, nous avons montré que la protéine IE4 partage les caractéristiques des facteurs d’export viraux.Nous avons montré que la protéine IE4 interagit avec trois protéines SR, à savoir ASF/SF2, 9G8 et SRp20. Nous avons identifié le domaine d’interaction au sein de la protéine IE4 et montré que ces interactions ne sont pas dépendantes de la présence d’ARN. Nous avons démontré que la protéine IE4 interagit avec la principale kinase phosphorylant les protéines SR, SRPK1, et qu’elle estphosphorylée par cette kinase. Nous avons montré que la protéine IE4 se lie à l’ARN, et que la présence d’ARN stabilise des complexes contenant la protéine IE4 et les facteurs d’export cellulaires TAP/NXF1 et Aly/REF. Enfin, nous avons déterminé l’influence de la protéine IE4 sur l’export de messagers rapporteurs, et clairement montré que l’infection par le VZV utilise le facteur d’export TAP/NXF1 pour exporter certains transcrits viraux.Nous avons donc mis en évidence un nouvel exemple de facteur d’export viral et proposé en modèle d’export des messagers viraux régulé par la protéineIE4. Nos résultats démontrent clairement que les herpesvirus ont développé différents mécanismes pour réguler l’export des ARN dans le but d’altérer l’expression des gènes cellulaires au profit de l’expression des gènes viraux