La técnica de impregnación argéntica de Golgi. Conmemoración del centenario del premio nobel de Medicina (1906) compartido por Camillo Golgi y Santiago Ramón y Cajal

The Golgi silver impregnation technique is a simple histological procedure that reveals complete three-dimensional neuron morphology. This method is based in the formation of opaque intracellular deposits of silver chromate obtained by the reaction between potassium dichromate and silver nitrate (black reaction). Camillo Golgi, its discoverer, and Santiago Ramón y Cajal its main exponent, shared the Nobel Prize of Medicine and Physiology in 1906 for their contribution to the knowledge of the nervous system structure, Their successes were largely due to the application of the silver impregnation method. However, Golgi and Cajal had different views on the structure of nervous tissue. According to the Reticular Theory, defended by Golgi, the nervous system was formed by a network of cells connected via axons within a syncytium. In contrast, Cajal defended the Neuron Doctrine which maintained that the neurons were independent cells. In addition, Golgi had used a variant of his "black reaction" to discover the cellular organelle that became known as the Golgi apparatus. Electron microscopy studies confirmed the postulates of the Neuron Doctrine as well as the existence of the Golgi complex and contributed to a resurgence of use of the Golgi stain. Although modern methods of intracellular staining reveal excellent images of neuron morphology, the Golgi technique is an easier and less expensive method for the study of normal and pathological morphology of neurons.La técnica de Golgi es un sencillo procedimiento histológico que revela la morfología neuronal completa en tres dimensiones. Este método se fundamenta en la formación de depósitos opacos intracelulares de cromato argéntico, producto de la reacción entre el bicromato de potasio y el nitrato de plata (reacción negra). Camillo Golgi, su descubridor, y Santiago Ramón y Cajal, su principal exponente, recibieron el premio nobel de Medicina y Fisiología en 1906 por su contribución al conocimiento de la estructura del sistema nervioso. Gran parte de sus logros se obtuvieron a través de la aplicación del método de impregnación argéntica. Sin embargo, Golgi y Cajal tenían interpretaciones diferentes sobre la estructura del tejido nervioso. Golgi era defensor de la teoría reticular, la cual proponía que el sistema nervioso estaba conformado por una red de células fusionadas a través de los axones a manera de un sincitio. Por el contrario, la doctrina neuronal, defendida por Cajal, sostenía que las neuronas eran células independientes. También se debe a Golgi y su reazione nera el descubrimiento del organelo celular conocido como ‘aparato de Golgi'. La microscopía electrónica confirmó los postulados de la doctrina neuronal, así como la existencia del complejo de Golgi, y contribuyó al resurgimiento de la técnica de impregnación argéntica. Aunque existen métodos modernos de tinción intracelular que revelan imágenes excelentes de la morfología neuronal, la técnica de Golgi se mantiene vigente por ser un método más práctico y menos costoso para el estudio de la morfología normal y patológica de las neuronas

Esporas de microsporidios: nueva apariencia con el microscopio electrónico

The phylum Microsporidia comprises a great number of species of parasitic protozoa which are ubiquitous in nature. Some species have medical importante as causative agents of opportunistic infections in AlDS patients. Since the first electron microscope description of the microsporidian spore (1), they have been shown as in figures 1-2. The spore wall shows two layers: the endospore and the exospore. The endospore appears transparent. The internal content of the spore (sporoplasm) is not easily seen because it looks dark and the spores are often broken after thin sectioning. Moreover, sections of the polar tube show a dark central core surrounded by a clear ring. Microsporidian spores of any species are observed as described above when fixed with the conventional osmium tetroxide (OsO4) fixation method. These spore features are very useful for the taxonomy of the Microsporidia (2). A new methodological procedure for electron microscopy makes other ultrastructural details of the spore wall visible (3). Figures 3-4 show the first images of whole spores of Microsporidia as seen by ruthenium tetroxide (Ru04) fixation. Besides revealing the content of the endospore, the internal structure of the sporoplasm looks well preserved. The appearance of the polar tube in section differs from that of the polar tube when fixed with osmium tetroxide. The central core is clear and the surrounding ring is electron-dense. This feature was also observed in spores of Polydispyrenia simulii (3). Differences in electron density of the layers of the polar tube could be explained by different lipid composition in accordance with the fixative properties of OsO4 and RuO4 (3). These images complement the description of the microsporidian spore presented in a previous paper (3).El phylum Microsporidia comprende un gran número de especies de protozoarios parásitos ubicuos en la naturaleza. Algunas tienen importancia médica como agentes causales de infecciones oportunistas en pacientes con sida. Desde las primeras imágenes de esporas de microsporidios obtenidas con el microscopio electrónico (1), su apariencia ha sido la mismaquese observa en lasfiguras 1-2. La pared de la espora exhibe dos capas: la endospora y la exospora. La endospora es de apariencia transparente y el contenido interno de la espora (esporoplasma) no se distingue fácilmente porque es muy oscuro y se rompe con los cortes ultrafinos. Otra imagen característica es la del tubo polar que en corte transversal muestra un centro oscurO rodeado por un anillo claro. Así se ven las esporas de microsporidios de cualquier especie cuando se fijan con el método convencional de fijación con tetróxido de osmio (OsO4 ). Estos rasgos ultraestructurales de las esporas son muy útiles para la taxonomiadel phylum Microsporidia (Microspora) (2). Un nuevo procedimiento para la microscopia electrónica de los microsporidios, basado en la utilización de tetróxido de rutenio como fijador, revela otros detalles ultraestructurales de la pared de la espora (3). En este artículo se exhiben las primeras imágenes de las esporas completas de microsporidios procesadas con este método. Se revela el contenido de la endospora y se preserva mejor la estructura del esporoplasma. El tubo polar en corte transversal difiere del tubo polar fijado con tetróxido de osmio. El centro es claro y está rodeadopor un anillo oscuro. Esta diferencia también se observa en las esporas de Polydispyrenia sirnulii (3). El contraste en la densidad electrónica de las capas del tubo polar podría explicarse por diferencias en la composición de lípidos de acuerdo con las propiedades de los dos fijadores (OsO4 y Ruo4) (3). Estas imágenes completan la descripción de las esporas de microsporidios presentada en un artículo anterior (3)

Efecto comparativo del tetróxido de osmio y del tetróxido de rutenio como fijadores sobre la ultraestructura de la pared celular de hongos

The fungal cell wall viewed through the electron microscope appears transparent when fixed by the conventional osmium tetroxide method. However, ruthenium tetroxide post-fixing has revealed new details in the ultrastructure of Penicillium sp. hyphae and Saccharomyces cerevisiae yeast. Most significant was the demonstration of two or three opaque diverse electron dense layers on the cell wall of each species. Two additional features were detected. Penicillium septa presented a three-layered appearance and budding S. cerevisiae yeast cell walls showed inner filiform cell wall protrusions into the cytoplasm. The combined use of osmium tetroxide and ruthenium tetroxide is recommended for post-fixing in electron microscopy studies of fungi.Al microscopio electrónico, la pared celular de los hongos es de apariencia translúcida en especímenes procesados mediante la posfijación convencional con tetróxido de osmio. La posfijación con tetróxido de rutenio reveló nuevos detalles ultraestructurales en hifas de Penicillium sp. y en levaduras de Saccharomyces cerevisiae. El aspecto más destacado fue la modificación en la transparencia de la pared celular, característica de la fijación con tetróxido de osmio. El tetróxido de rutenio permite verla como una estructura compuesta por dos o tres capas oscuras de diferente tonalidad. Se observaron también otros dos rasgos importantes: los septos en las hifas de Penicillium sp. presentaban una apariencia trilaminar y en la pared celular de las levaduras de S. cerevisiae, en etapa de gemación, se destacaban unas prolongaciones filiformes que emergían desde la capa interna y se proyectaban hacia el citoplasma. Se recomienda el uso combinado de los dos fijadores en estudios ultraestructurales de los hongos

Estandarización de un protocolo para la combinación de técnicas neurohistológicas en cortes obtenidos con vibrátomo

Introduction. The histological study of the nervous system requires the use of special techniques. Currently, no methods are available to visualize simultaneously all the cellular constituents of nervous tissue.Objectives. A protocol was adapted for staining nervous tissue by modification of a formerly difficult procedure.Materials and methods. Slices of brain and spinal cord, 4 mm thick, were taken from adult mice, previously fixed by intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde. Vibratome sections were obtained with thickness of 15-25 μm. These were mounted on glass slides prepared with gelatin as an adhesive. The preparations were subjected to staining protocol Luxol Fast Blue-PAS-hematoxylin (LPH) combined with silver staining method (LPH-Holmes).Results. LPH technique yielded an excellent differentiation of gray and white matter in all regions of the nervous system. A panoramic view of the gray matter was colored pink in contrast to the myelinated nerve fibers and tracts which were light blue. The combination LPH-Holmes retained the staining characteristics but significantly improved the demarcation of axons and tracts.Conclusions. A protocol was standardized for the LPH and LPH-Holmes nervous tissue stains applied in combination to tissue slices obtained with a vibratome. The method was shorter, less wasteful and less expensive than the original and also better preserved the integrity of nervous tissue.Introducción. El estudio histológico del sistema nervioso ha requerido del uso de técnicas especiales. Esto se debe a que no existen métodos que permitan visualizar, simultáneamente, todos los constituyentes celulares del tejido nervioso.Objetivos. Adaptar un protocolo para llevar a cabo un método de coloración del tejido nervioso, previamente conocido pero poco utilizado hasta ahora, debido a las dificultades que presenta el procedimiento original.Materiales y métodos. Se trabajó con cortes de encéfalo y médula espinal de 4 mm de espesor, extraídas de ratones adultos previamente fijados mediante perfusión intracardiaca con paraformaldehído al 4 %. En un vibrátomo se obtuvieron cortes de 15 a 25 μm de espesor. Éstos se montaron sobre láminas portaobjeto preparadas con gelatina como adhesivo. Las preparaciones se sometieron al protocolo de coloración Luxol Fast Blue-PAS-Hematoxylin (LPH) y, su combinación, con un método de tinción argéntica (LPH-Holmes).Resultados. La técnica LPH permitió obtener una excelente diferenciación de la sustancia gris y la sustancia blanca en todas las regiones del sistema nervioso. En una vista panorámica, la sustancia gris se observa de color rosado, mientras que las fibras y tractos nerviosos con mielina se apreciaron de color azul claro. La combinación LPH-Holmes conservó las características de la tinción, pero mejoró ostensiblemente la demarcación de los axones y tractos.Conclusiones. Se estandarizó un protocolo para llevar a cabo la tinción LPH y su combinación LPH-Holmes en cortes obtenidos con un vibrátomo. Éste es más corto, menos dispendioso y menos costoso que el original y, además, preserva mejor la integridad del tejido nervioso

Disminución del número de neuronas que expresan GABA en la corteza cerebral de ratones infectados con rabia

Introduction. GABAergic neurons synthesize and release gamma-aminobutyric acid, the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. Certain clinical signs of rabies and previous experimental studies have suggested that rabies viral infections affect the host GABAergic system.Objective. The effect of rabies virus infection on the expression of GABA was evaluated in neurons of the mouse cerebral cortex.Materials and methods. Adult mice were inoculated by intramuscular injection with the standard strain of rabies (CVS virus). The animals were sacrificed in the terminal stage of the illness and perfused with 4% paraformaldehyde and 1% glutaraldehyde. Frontal sections were obtained in a Vibratome® and treated with appropriate immunohistochemical reactions for identifying the GABAergic neurons in the cerebral cortex. Counts and comparative quantitative analysis of the GABA+ neurons were compared in samples of infected and normal mice.Results. In the animals infected with rabies virus, the distribution pattern of cortical GABAergic neurons was not changed, but their number diminished significantly. The mean value of GABA+ cells number in 1 μm2 of cerebral cortex was 293±32 in normal samples and 209±13 in infected samples. Despite the loss in GABA+ cell number, the average size of GABA+ cells per unit increased from 104±8 μm2 in normal mice to 122±10 μm2 in infected mice because the cell loss consisted more frequently of smaller neurons. Nevertheless, the rank of GABA+ cell sizes in infected samples was similar to normal samples.Conclusion. This evidence supported the hypothesis that GABA is involved in rabies pathology.Introducción. Algunos signos clínicos de la rabia y estudios experimentales previos sugieren que esta infección viral podría afectar al sistema GABAérgico.Objetivo. Evaluar el efecto de la infección con el virus de la rabia sobre la expresión de GABA en neuronas de la corteza cerebral de ratón.Materiales y métodos. Se inocularon ratones adultos con virus CVS de la rabia por vía intramuscular. Los animales se sacrificaron en la etapa terminal de la enfermedad y se fijaron por perfusión con paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 1%. Se procesaron cortes coronales de cerebro obtenidos en un Vibratome®, mediante inmunohistoquímica para identificar neuronas GABAérgicas en la corteza cerebral. Se realizaron conteos y análisis cuantitativo de las neuronas positivas para GABA en muestras de ratones normales e infectados.Resultados. En los animales infectados con rabia no se alteró el patrón de distribución de las neuronas GABAérgicas corticales pero su número disminuyó significativamente. El promedio de células positivas para GABA en 1 mm2 de corteza fue de 293±32 en los controles y de 209±13 en los infectados. Por otra parte, el valor promedio del área de los perfiles neuronales positivos para GABA aumentó significativamente de 104±8 μm2 en los controles a 122±10 μm2 en las muestras infectadas, debido a que la pérdida de células positivas para GABA fue más evidente en las neuronas de menor tamaño. No obstante, el rango de tamaños de las células inmunopositivas para GABA fue similar en muestras de animales normales e infectados.Conclusiones. Este trabajo aporta nueva evidencia en favor de la hipótesis que propone la participación del GABA en la fisiopatología de la rabia

Efectos de los coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV) en el sistema nervioso. ¿Qué esperar del SARS-CoV-2?

Coronaviruses cause respiratory and gastrointestinal disorders in animals and humans. The current SARS-CoV-2, the COVID-19 infectious agent, belongs to a subgroup called betacoronavirus including the SARS-CoV and MERS-CoV responsible for epidemics in 2002 and 2012, respectively. These viruses can also infect the nervous system due to their affinity for the human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) expressed in neurons and glial cells. Infections with SARS-CoV, MERS-CoV, and now SARS-CoV-2 also produce neurological signs such as acute cerebrovascular disease, impaired consciousness, and muscle injury, as well as dizziness, hypogeusia, hyposmia, hypoxia, neuralgia, and hypoxic encephalopathy. For this reason, close attention should be paid to the neurological manifestations of COVID-19 patients.Los coronavirus son una familia de virus que se caracterizan por producir afectaciones respiratorias y gastrointestinales en animales y en seres humanos. El actual SARS-CoV-2, agente infeccioso de la COVID-19, pertenece a un subgrupo denominado betacoronavirus del que hacen parte el SARS-CoV y MERS-CoV, virus responsables de epidemias en el 2002 y el 2012, respectivamente.Estos virus también pueden infectar el sistema nervioso debido a su afinidad con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2), la cual se expresa en neuronas y células gliales. Se ha demostrado que las infecciones con SARS-CoV y MERS-CoV, y ahora también con el SARS-CoV-2, ocasionan condiciones neurológicas como la enfermedad cerebrovascular aguda, la conciencia alterada y las lesiones musculares, así como mareos, hipogeusia, hiposmia, hipoxia, neuralgia y encefalopatía hipóxica. Por ello debe prestarse mucha atención a las manifestaciones neurológicas de los pacientes de COVID-19

Distribución de calbindina y parvoalbúmina y efecto del virus de la rabia sobre su expresión en la médula espinal de ratones

Introduction: Rabies is a fatal infectious disease of the nervous system; however, the knowledge about the pathogenic neural mechanisms in rabies is scarce. In addition, there are few studies of rabies pathology of the spinal cord.Objective: To study the distribution of calcium binding proteins calbindin and parvalbumin and assessing the effect of rabies virus infection on their expression in the spinal cord of mice.Materiales y methods: Mice were inoculated with rabies virus, by intracerebral or intramuscular route. The spinal cord was extracted to perform some crosscuts which were treated by immunohistochemistrywith monoclonal antibodies to reveal the presence of the two proteins in normal and rabies infected mice. We did qualitative and quantitative analyses of the immunoreactivity of the two proteins.Results: Calbindin and parvalbumin showed differential distribution in Rexed laminae. Rabies infection produced a decrease in the expression of calbindin. On the contrary, the infection caused an increasedexpression of parvalbumin. The effect of rabies infection on the two proteins expression was similar when comparing both routes of inoculation.Conclusion: The differential effect of rabies virus infection on the expression of calbindin and parvalbumin in the spinal cord of mice was similar to that previously reported for brain areas. This resultsuggests uniformity in the response to rabies infection throughout the central nervous system. This is an important contribution to the understanding of the pathogenesis of rabies. doi: http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v33i4.1552Introducción. Aunque se trata de una enfermedad infecciosa del sistema nervioso, poco se conoce sobre los mecanismos patogénicos de la infección con el virus de la rabia. En particular, son escasos los estudios sobre su histopatología en la médula espinal.Objetivo. Estudiar la distribución de las proteínas calbindina y parvoalbúmina, en la médula espinal de ratones y evaluar el efecto de la infección con el virus de la rabia sobre su expresión.Materiales y métodos. Se inocularon ratones con virus de la rabia, por vía intracerebral o intramuscular, y se extrajo la médula espinal para hacer cortes transversales, los cuales se sometieron a tratamiento inmunohistoquímico con anticuerpos monoclonales para revelar la presencia de las dos proteínas en ratones normales y en animales infectados. Se llevó a cabo el análisis cualitativo y cuantitativo de la inmunorreacción de las dos proteínas.Resultados. Las proteínas calbindina y parvoalbúmina se distribuyeron de manera diferencial en las láminas de Rexed. La infección con el virus de la rabia produjo una disminución en la expresión de calbindina. Por el contrario, la infección provocó un incremento en la expresión de parvoalbúmina. El efecto de la rabia sobre las dos proteínas fue similar al comparar las dos vías de inoculación.Conclusión. El efecto diferencial de la infección con el virus de la rabia sobre calbindina y parvoalbúmina en la médula espinal de ratones, es similar al reportado anteriormente para áreas encefálicas. Esto sugiere uniformidad en su respuesta a la infección en todo el sistema nervioso central y es un aporte importante para el conocimiento de la patogénesis de la rabia. doi: http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v33i4.155

Immunoreactivity to calbindin in purkinje cells in the cerebellum of mice is not affected by rabies virus infection

Introducción: La calbindina (CB) es una proteína reguladora del calcio intracelular y la célula de Purkinje del cerebelo es la neurona con más alta concentración de CB. Se ha demostrado pérdida de inmunorreactividad a CB en diferentes áreas del sistema nervioso en ratones inoculados con virus de la rabia, pero faltaba estudiar este fenómeno en el cerebelo. Objetivo: Determinar el efecto de la inoculación con virus de la rabia sobre la expresión de CB en células de Purkinje del cerebelo de ratones. Metodología: Se inocularon ratones con el virus por vía intramuscular. Se sacrificaron los animales cuando alcanzaron la fase avanzada de la enfermedad y se fijaron mediante perfusión intracardiaca con paraformaldehído al 4%. Se les extrajo el cerebelo y se hicieron cortes sagitales de 50 micrómetros de espesor en un vibrátomo. Estos se procesaron mediante inmunohistoquímica para revelar la presencia de CB o de antígenos del virus de la rabia. El mismo procedimiento se realizó con animales no infectados (controles). Resultados: Las células de Purkinje fueron masivamente infectadas con el virus de la rabia. En las imágenes panorámicas observadas en el microscopio se comprobó que sólo estas células fueron inmunorreactivas a CB. No se hallaron diferencias significativas en la inmunorreactividad a CB, evaluada por densitometría óptica, entre los animales infectados y los controles. Conclusión: La expresión de CB en las células de Purkinje del cerebelo parece no afectarse por la infección con rabia, a diferencia de lo que se ha demostrado en otras áreas del sistema nervioso del ratón.Introduction: Calbindin (CB) is a regulatory protein of intracellular calcium, and the cerebellar Purkinje cell is the neuron with the highest concentration of CB. Loss of CB immunoreactivity has been demonstrated in different areas of the nervous system in rabies virus-infected mice, but the study of this phenomena in the cerebellum lacked. Objective: To determine the effect of inoculation with rabies virus on the expression of CB in Purkinje cells of the cerebellum of mice. Methodology: Mice were intramuscularly inoculated with rabies virus. Animals were sacrificed when they reached an advanced stage of the disease and then they were fixed by intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde. Cerebellums were extracted and sagittal sections 50 microns thick were obtained in a vibratome. These were processed by immunohistochemistry to reveal the presence of CB protein or rabies virus antigens. The same procedure was performed with uninfected animals (controls). Results: Purkinje cells were massively infected with rabies virus. In the microscopic panoramic images observed was found that only these cells are immunoreactive to CB. No significant difference in CB immunoreactivity evaluated by optical densitometry was found between infected animals and controls. Conclusion: The expression of CB in Purkinje cells of the cerebellum appears not to be affected by infection with rabies unlike what has been shown in other areas of the mouse nervous system

Efecto de la degradación post mórtem sobre la detección inmunohistoquímica de antígenos en el cerebro de ratón

Si bien lo ideal es llevar a cabo la preservación de los tejidos en el menor tiempo posible luego de la muerte de un animal objeto de un estudio neurohistoquímico, con frecuencia es inevitable trabajar con tejido nervioso obtenido varias horas post mórtem

Neuroanatomical evidence of the transport of the rabies virus through the propriospinal tract in the spinal cord of mice

Introduction: Information about the neuroanatomical details of the ascendant transport of the rabies virus through the spinal cord is scarce. Objective: To identify the neuroanatomical route of dissemination of the rabies virus at each of the levels of the spinal cord of mice after being inoculated intramuscularly. Materials and methods: Mice were inoculated with the rabies virus in the hamstrings. After 24 hours post-inoculation, every eight hours, five animals were sacrificed by perfusion with paraformaldehyde. Then, the spinal cord was removed, and transverse cuts were made at the lumbosacral, thoracic, and cervical levels. These were processed by immunohistochemistry for the detection of viral antigens. Results: The first antigens of rabies were observed as aggregated particles in the lumbar spinal cord at 24 hours post-inoculation, within the ventral horn in the same side of the inoculated limb. At 32 hours post inoculation the first motoneurons immunoreactive to the virus became visible. At 40 hours postinoculation the first immunoreactive neurons were revealed in the thoracic level, located on lamina 8 and at 48 hours post-inoculation in the cervical cord, also on lamina 8. At 56 hours post-inoculation the virus had spread throughout the spinal cord, but the animals still did not show signs of the disease. Conclusion: In the mouse model we used, the rabies virus entered the spinal cord through the motoneurons and probably used the descending propriospinal pathway for its retrograde axonal transport to the encephalus