A Capsid-Encoded PPxY-Motif Facilitates Adenovirus Entry

Viruses use cellular machinery to enter and infect cells. In this study we address the cell entry mechanisms of nonenveloped adenoviruses (Ads). We show that protein VI, an internal capsid protein, is rapidly exposed after cell surface attachment and internalization and remains partially associated with the capsid during intracellular transport. We found that a PPxY motif within protein VI recruits Nedd4 E3 ubiquitin ligases to bind and ubiquitylate protein VI. We further show that this PPxY motif is involved in rapid, microtubule-dependent intracellular movement of protein VI. Ads with a mutated PPxY motif can efficiently escape endosomes but are defective in microtubule-dependent trafficking toward the nucleus. Likewise, depletion of Nedd4 ligases attenuates nuclear accumulation of incoming Ad particles and infection. Our data provide the first evidence that virus-encoded PPxY motifs are required during virus entry, which may be of significance for several other pathogens

PIP30/FAM192A is a novel regulator of the nuclear proteasome activator PA28γ

PA28γ is a nuclear activator of the 20S proteasome involved in the regulation of several essential cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis, nuclear dynamics, and cellular stress response. Unlike the 19S regulator of the proteasome, which specifically recognizes ubiquitylated proteins, PA28γ promotes the degradation of several substrates by the proteasome in an ATP- and ubiquitin-independent manner. However, its exact mechanisms of action are unclear and likely involve additional partners that remain to be identified. Here we report the identification of a cofactor of PA28γ, PIP30/FAM192A. PIP30 binds directly and specifically via its C-terminal end and in an interaction stabilized by casein kinase 2 phosphorylation to both free and 20S proteasome-associated PA28γ. Its recruitment to proteasome-containing complexes depends on PA28γ and its expression increases the association of PA28γ with the 20S proteasome in cells. Further dissection of its possible roles shows that PIP30 alters PA28γ-dependent activation of peptide degradation by the 20S proteasome in vitro and negatively controls in cells the presence of PA28γ in Cajal bodies by inhibition of its association with the key Cajal body component coilin. Taken together, our data show that PIP30 deeply affects PA28γ interactions with cellular proteins, including the 20S proteasome, demonstrating that it is an important regulator of PA28γ in cells and thus a new player in the control of the multiple functions of the proteasome within the nucleus

Prix Nobel de Chimie 2004 : Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose. L’étiquette de la mort

Aaron Ciechanover, 57 ans, Israélien, né le 1er octobre 1947 à Haïfa, Israël, obtient en 1974 son Doctorat en médecine à l’Hebrew University-Hadassah Medical School de Jérusalem puis, en 1981, son PhD à l’Institut de technologie d’Israël (Technion) de Haïfa. Il y est professeur de biochimie et dirige l’Institut Rappaport de recherche médicale. Membre du Conseil de l’EMBO (European molecular biology organization), de l’Académie européenne des arts et des sciences, il a reçu en 2000 le Prix Albert-Lasker (conjointement avec les professeurs Avram Hershko et Alexander Varshavsky).Avram Hershko, 67 ans, Israëlien, né le 31 décembre 1937 à Karcag, Hongrie, émigre en Israël en 1950 et obtient en 1965 son Doctorat en médecine puis, en 1969, son PhD à l’Hebrew University-Hadassah Medical School de Jérusalem. Professeur de biochimie depuis 1972 à l’Institut de technologie d’Israël (Technion) de Haïfa, il y est depuis 1998 Professeur émérite. Membre de l’EMBO (European molecular biology organization) et de l’Académie des sciences d’Israël, Foreign associate de la National Academy of Sciences américaine, il a reçu en 2000 le Prix Albert-Lasker (conjointement avec les professeurs Aaron Ciechanover et Alexander Varshavsky).Irwin Rose, Américain, né le 16 juillet 1926 à New York, obtient en 1952 son Doctorat en médecine et son PhD à l’Université de Chicago. Professeur de biochimie au Fox Chase Cancer Center de Philadelphia où il effectue toute sa carrière, il est encore, à 78 ans, rattaché, au titre de Professeur émérite, au Département de physiologie et de biophysique du College of Medicine de l’Université de Californie, à Irvine

L’étiquette de la mort

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Etude du protéasome "ancestral" HslVU de Leishmania major

HslVU est une protéase dépendante de l'ATP découverte initialement chez certaines bactéries, et considérée comme une forme ancestrale du protéasome. Elle est constituée par l'association de deux sous-complexes : la protéase HslV, formée elle-même de deux anneaux hexamériques de la sous-unité HslV, et l'ATPase HslU, un hexamère de la sous-unité HslU, qui active l'activité peptidasique de HslV en s'associant à l'une ou à ses deux extrémités. HslVU a été identifiée dans la mitochondrie de protozoaires parasites, dont ceux de la famille des trypanosomatidae comme Leishmania major (agent de la leishmaniose) et Trypanosoma brucei (agent de la maladie du sommeil). Différents travaux ont montré que, chez T. brucei, l'inactivation d'HslVU par interférence ARN conduit à l'arrêt de la division cellulaire et à la mort du parasite. Puisqu'elle est absente chez l'homme, HslVU constitue donc une cible thérapeutique potentielle intéressante pour lutter contre ces parasites. Dans le cadre d'un projet collaboratif, le but de ma thèse était de caractériser la protéase HslVU de Leishmania major (LmHslVU), et de tester l'intérêt d'exploiter la symétrie de HslV pour développer des inhibiteurs empêchant la formation du complexe HslVU en se fixant à l'interface HslV/HslU. Dans ce contexte, ma thèse s'est développée autour de 3 axes principaux : (i) Production et caractérisation biochimique de LmHslV recombinant. J'ai montré que le complexe LmHslV seul est inactif, contrairement à son homologue bactérien qui a une activité basale même sans HslU, et qu'il peut être activé par des peptides synthétiques correspondant à l'extrémité C-terminale de son régulateur HslU, comme HslV d'E.coli et d'H.influenzae. Cela m'a permis de développer un test de l'activité peptidasique de LmHslV in vitro, miniaturisable pour un futur criblage de banques de molécules chimiques. La protéase LmHslV a également été caractérisée en testant l'effet de différents inhibiteurs de protéases sur son activité. Ce travail m'a également permis de montrer que l'activité peptidasique de HslV est très sensible à la présence d'ions Mg2+ dans les tampons d'activité, ce qui suggère qu'il existe des régulations allostériques des sites actifs de la protéase. (ii) Exploiter la symétrie de HslV pour développer des interacteurs multivalents de HslV. Nous avons cherché à vérifier expérimentalement si le fait d'utiliser des molécules multivalentes, c'est à dire possédant plusieurs sites d'interaction à HslV, permettait d'augmenter sensiblement l'affinité de ces molécules. Une molécule pentamérique, le peptabody , capable de se fixer sur LmHslV via cinq sites d'interaction potentiels et agissant comme un inhibiteur de l'activité peptidasique de HslV, a été développée.(iii) Caractérisation du mode d'activation de LmHslV. Nous avons réalisé en collaboration des expériences de microscopie électronique sur LmHslV, qui ont révélé une possible rotation des deux anneaux de LmHslV liée à l'activation de la protéase. Cette rotation est spécifique de LmHslV puisqu'on ne l'observe pas chez HslV d'E. coli. La confirmation de ces résultats encore préliminaires est en cours.HslVU is an ATP-dependent protease initially discovered in certain bacteria, and considered as a proteasome ancestor. It is formed by assembly of two subcomplexes: the HslV protease, itself resulting from the assembly of two hexameric rings of the HslV subunit, and the HslU ATPase, an hexamer of the HslU subunit that activates HslV upon binding.HslVU has been identified within the mitochondrion of protozoan parasites, including the Trypanosomatids Leishmania major (leishmaniasis) and Trypanosoma brucei (sleeping sickness). Different results have shown that inactivation by siRNA of HslVU leads in T. brucei to growth arrest and cell death. Since HslVU is absent in human, it thus represents an attractive drug target for the fight against these parasites. In the frame of a collaborative project, the objective of my thesis was to characterize the HslVU protease of Leishmania major (LmHslVU) and to assess the interest of exploiting HslV symmetry to develop inhibitory molecules that would block the formation of the HslVU complex by binding at the HslV/HslU interface.In this context, I studied three main issues during my PhD thesis:(i) Production and biochemical characterization of recombinant LmHslV: I could show that the HslV complex alone is inactive, contrary to its bacterial homolog which has a basal activity even in the absence of HslU, and that, as E. coli HslV, it can be activated by synthetic peptides corresponding to the C-terminal end of HslU. This work allowed me to develop an in vitro assay of HslV peptidase activity, that can be miniaturized for future screenings of chemical libraries. The active site of the LmHslV protease has also been characterized by testing the effect of different protease inhibitors on the peptidase activity. During this work, I could show that LmHslV activity is sensitive to Mg2+ ions in the activity buffers, suggesting the existence of allosteric regulations of the active sites.(ii) To exploit HslV symmetry to develop multivalent interactors of HslV. Our goal was to experimentally verify whether the use of multivalent molecules, i.e. molecules with several interaction sites to HslV, could help to develop high affinity inhibitors. A pentameric molecule, called the peptabody , able to bind to HslV via five interaction sites and acting as a strong inhibitor of HslV, has been developed.(iii) Characterization of the mode of activation of HslV. We performed through a collaboration electronic miscroscopy analyses of LmHslV, which revealed that the activation of the protease could be linked to a possible rotation of its two rings. Such rotation was not seen with E. coli HslV, suggesting that it is a mechanism specific of LmHslV. Study are ongoing to confirm these results.MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Etude du système ubiquitine-protéasome (analyse du rôle de la protéine hHR23/Rad23 dans l'ubiquitylation de p53 et recherche de cofacteurs du protéasome 26S)

Le système Ubiquitine-Protéasome (UbPr) est au cœur de la plupart des processus biologiques, du fait de son rôle central dans la protéolyse régulée. La dégradation d'une protéine via le système UbPr implique généralement deux grandes étapes successives: l'ubiquitylation de la protéine et sa dégradation par le protéasome 26S. Cependant, il reste de nombreuses questions quant au fonctionnement du système UbPr. Durant ma thèse, j'ai suivi deux axes de recherches visant à étudier l'étape mal caractérisée qu'est l'interface ubiquitylation/dégradation. Le premier était l'étude du rôle de la protéine Rad23/hHR23, décrite comme un adaptateur impliqué dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome, sur la régulation de l'ubiquitylation de la protéine p53 par Hdm2. J'ai montré que l'effet de Rad23 est double: en plus d'inhiber la multi-mono- et la poly-ubiquitylation de p53 par Hdm2, Rad23 favorise l'auto-ubiquitylation de Hdm2. Par ailleurs, j'ai confirmé que le domaine de Rad23 responsable de ces effets est le domaine UBA2, et j'ai montré que la dimérisation de Rad23 semble impliquée dans ces processus. Le deuxième axe était d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans l'adressage des substrats ubiquitylés au protéasome ou qui assistent ce dernier dans la protéolyse. Mon but était de purifier par fractionnement cellulaire des cofacteurs du protéasome qui ont un effet activateur sur la dégradation de la protéine p53 ubiquitylée. J'ai obtenu, dans un premier temps, des résultats très intéressants indiquant que le complexe PA28 ab pourrait jouer un rôle dans l'activation du protéasome 26S. Cependant, ces résultats n'ont pas pu être compris faute de temps et en raison de problèmes expérimentaux. Dans un second temps, j'ai purifié à partir des extraits cellulaires une autre activité qui était capable de s'associer et d'activer le protéasome 26S. J'ai ainsi identifié deux activateurs potentiels: la protéine Ecm29 et le complexe de traduction eIF3The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays a key role in most biological pathways, due to its central function in regulated proteolysis. Protein degradation through the UPS usually occurs in two main steps: ubiquitylation of proteins and subsequent degradation by the 26S proteasome. However, many open questions remain concerning UPS functioning. During my thesis, I followed two main research axes aimed at investigating the ill-understood ubiquitylation/degradation interface. One axis was to further study the role(s) in Hdm2-mediated p53 ubiquitylation of the Rad23/hHR23 protein, known to be an adaptator involved in addressing ubiquitylated substrates to the proteasome. I showed that Rad23 effect is twofold: in addition to inhibit both multi-mono- and poly-ubiquitylation of p53 by Hdm2, Rad23 somehow favors Hdm2 auto-ubiquitylation. Moreover, I confirmed that the domain responsible for the effects of Rad23 is its UBA2 domain, and showed that Rad23 dimerization might be involved in these processes. The second axis was aimed at identifying new cellular factors involved in targeting ubiquitylated substrates to the proteasome, or in assisting 26S proteasome during protein degradation. My goal was to purify and characterize proteins, through cell extract fractionation, having a positive effect on degradation of ubiquitylated p53 by purified 26S proteasome. Rapidly, my work was focused on the PA28 ab complex, that was found in active fractions, and I obtained striking results indicating that it could play a role in 26S activation. However, due to time constraints and technical difficulties, this part of my work could not be brought to a conclusive end yet. In a second part of this project, I purified from cell extracts another activity that is able to both bind to and activate the 26S proteasome. Two potential candidates were identified in the active fractions: the Ecm29 protein and the translational complex eIF3MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Roles and potential therapeutic targets of the ubiquitin proteasome system in muscle wasting.

Muscle wasting, characterized by the loss of protein mass in myofibers, is in most cases largely due to the activation of intracellular protein degradation by the ubiquitin proteasome system (UPS). During the last decade, mechanisms contributing to this activation have been unraveled and key mediators of this process identified. Even though much remains to be understood, the available information already suggests screens for new compounds inhibiting these mechanisms and highlights the potential for pharmaceutical drugs able to treat muscle wasting when it becomes deleterious. This review presents an overview of the main pathways contributing to UPS activation in muscle and describes the present state of efforts made to develop new strategies aimed at blocking or slowing muscle wasting. Publication history: Republished from Current BioData's Targeted Proteins database (TPdb; http://www.targetedproteinsdb.com)

βTrCP-dependent degradation of CDC25B phosphatase at the metaphase-anaphase transition is a pre-requisite for correct mitotic exit

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