NANOESTRUCTURAS BASADAS EN DENDRÍMEROS JANUS ANFIFÍLICOS COMO TRANSPORTADORES DE FÁRMACOS CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C

A pesar de las mejoras conseguidas en los últimos años, el tratamiento de la Hepatitis C continúa siendo un reto en algunos casos, lo que plantea la necesidad de encontrar nuevos fármacos contra el VHC (Virus de la Hepatitis C). Ciertos compuestos que exhiben una alta actividad antiviral en screenings primarios no prosperan debido a baja efectividad in vitro, baja solubilidad en agua o alta toxicidad. Una posible solución es la encapsulación de estos compuestos en nanotransportadores, que podría proporcionar nuevas opciones terapéuticas contra el VHC. Entre los diferentes nanomateriales utilizados actualmente como transportadores de fármacos, los dendrímeros Jano anfifílicos destacan por su abilidad de formar agregados hidrosolubles con un núcleo lipídico. En este trabajo se ha sintetizado un nuevo dendrón lipófilo basado en bis-GMPA. A partir de este se ha obtenido un dendrímero Jano anfifílico mediante una reacción de “química click”. Este dendrímero puede formar agregados micelares con una alta capacidad de carga de fármaco, de modo que ha sido probado como transportador para tres fármacos contra el VHC: camptotecina, tiratricol y ácido iopanoico. Tanto los agregados como los complejos fármaco/dendrímero han sido caracterizados de varias maneras: la morfología y el tamaño se han determinado por microscopía de transmisión electrónica y dispersión dinámica de luz, y los parámetros termodinámicos de la interacción entre los diferentes fármacos y el dendrímero se ha estudiado por calorimetría isotérmica de titulación. Finalmente, se han evaluado los resultados de la encapsulación sobre la inhibición viral y la viabilidad celular, utilizando un cultivo de una línea celular hepática apropiada. No se han obtenido resultados concluyentes con respecto a la actividad antiviral de los complejos fármaco/dendrímero. Sin embargo, los datos preliminares obtenidos en este trabajo sugieren que este nanotransportador podría mejorar la actividad de los fármacos encapsulados sin afectar a la viabilidad celular

Tratamientos actuales para el Síndrome de Duplicación de MECP2

Methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2) is a small, intrinsically disordered protein which has a role in gene activation and repression, and chromatin compaction. When MECP2 gene, located in the X chromosome, suffers a duplication, MeCP2 expression increases, leading to the outbreak of seizures, hypotonia, autistic features and respiratory infections. This disorder is known as MECP2 Duplication Syndrome (M2DS).The aim of this Master’s thesis is to gather all the existing drug trials and auxiliar treatments for M2DS.The search returned 10 cases of drug trials (6 performed on humans, 1 on human iPSCs and 3 on M2DS mouse models). Anticonvulsants are the most frequently prescribed drugs on young patients, although antisense oligonucleotides (ASOs) and CRISPR-Cas9 gene editing are being developed in preclinic studies. The main auxiliar therapies found for M2DS were occupational, physical and speech therapy.Valproic acid (VPA) is the most used anticonvulsant for the treatment of seizures in children with M2DS, but other drugs have also proven to be effective, such as lamotrigine (LTG) and topiramate (TPM). The screening of small compounds able to destabilize the MeCP2-DNA union could also be a fruitful source of long-term drugs against M2DS. Auxiliar therapies will continue to be imperative until a full phenotype reversal can be achieved in human patients via gene editing.<br /

Vehiculización de compuestos efectivos frente al Virus de la Hepatitis C (VHC)

En este proyecto, “Vehiculización de compuestos efectivos frente al Virus de la Hepatitis C (VHC)”, se ha pretendido por una parte estudiar el comportamiento de las nanopartículas de oro modificadas y no modificadas con galactosa en su superficie (AuNPGal y AuNPTris respectivamente). Los estudios realizados ofreciendo los dos tipos de AuNPs a tres tipos celulares diferentes, nos han permitido validar un método de detección de la cantidad de AuNPs que son incorporadas a las células tras realizar experimentos paralelos de citometría de flujo y microscopía. Así se ha determinado que la modificación con galactosa es necesaria para la correcta entrada de nanopartículas a la célula, ya que en caso contrario las nanopartículas quedan absorbidas en la superficie celular. Aunque parece que los datos indican que las AuNPGal entrarían a la célula utilizando los receptores de galactosa, no se ha podido concluir de forma clara el mecanismo de entrada y se están llevando a cabo estudios que lo determinen. Por otra parte se ha pretendido validar la estrategia de vehiculización de los compuestos antivirales previamente identificados en el grupo de investigación, (OAVx) utilizando ciclodextrinas. Aunque la formación de complejos OAVx-Ciclodextrinas no ha sido posible de cuantificar mediante absorbancia, utilizando calorimetría isotérmica de titulación de determinaron las constantes de unión y los parámetros termodinámicos de la formación d complejos. Mediante el uso de un algoritmo gratuito en la red, se ha obtenido una simulación que nos permite tanto visualizar los grupos funcionales a través de los cuales se produce la interacción como cuantificar la superficie del compuesto que interacciona. Una vez formados los complejos, se ha determinado la actividad antiviral de los mismos, utilizando líneas celulares que portan un sistema en el que se mimetiza el ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. Ha sido posible rescatar compuestos que aunque habían sido seleccionados por su demostrada eficacia in vitro, no lo hacían a nivel celular. Este proyecto máster ha contribuido de forma importante al desarrollo del proyecto global en el que se enmarca. Los datos obtenidos con las AuNPs permiten seleccionar el tipo de nanopartícula al que se le unirá la CDx (tras su modificación química correspondiente) y posteriormente se formará el complejo con el compuesto OAV de interés

Síntesis, estudio y caracterización de dendrímeros globulares como transportadores unimoleculares de fármacos contra la hepatitis C: toxicidad, internalización y actividad terapéutica

En los últimos años se han conseguido mejoras en el desarrollo de nuevos tratamientos frente a la hepatitis C. No obstante, debido a la aparición de resistencias y a que los tratamientos no son eficaces en todas las poblaciones, surge la necesidad de encontrar nuevas terapias. Previamente se identificaron, mediante procesos de ”screening”, posibles compuestos con actividad antiviral, entre los que se encuentran el ácido iopanoico y el tiratricol. Sin embargo, éstos no presentaban una buena actividad antiviral en ensayos in vitro, por lo que se plantea la necesidad de alternativas. Entre ellas se encuentra la llevada a cabo en este trabajo, la encapsulación de fármacos en macromoléculas que sirvan de transportadores; en este caso, se ha empleado un polímero hiperramificado dendronizado. Esta molécula, sintetizada como parte de este trabajo, presenta un núcleo central lipofílico basado en bisMPA y está funcionalizada con dendrones basados en bisGMPA en la periferia. Se ha empleado para la encapsulación de tiratricol y ácido iopanoico, y también para encapsular ribavirina, un fármaco utilizado previamente como tratamiento de la hepatitis C, pero con peores resultados que los tratamientos actuales. La morfología y el tamaño de los encapsulados y el derivado dendrítico vacío se han caracterizado mediante microscopía electrónica de transmisión. Tanto los tres fármacos encapsulados, como el derivado dendrítico vacío, se han estudiado en ensayos celulares para comprobar su actividad antiviral y su citotoxicidad. Además, en el caso de los encapsulados, la actividad antiviral se ha comparado con la de los fármacos libres. Los encapsulados de ribavirina y tiratricol no han parecido mejorar el efecto del fármaco libre, mientras que los encapsulados de ácido iopanoico sí. No obstante, es necesario realizar más ensayos que confirmen estos resultados puesto que los realizados en este trabajo no son suficientemente fiables si tenemos en cuenta los valores de los controles obtenidos

Identificación de compuestos bioactivos dirigidos frente a NUPR1, una proteína intrínsecamente desordenada implicada en el adenocarcinoma pancreático

El adenocarcinoma ductal de páncreas es uno de los cánceres con peor pronóstico, de ahí la necesidad de búsqueda de nuevos fármacos para combatirlo. La proteína NUPR1 es una proteína intrínsecamente desestructurada (IDP) muy sobreexpresada en este tipo de tumores y con evidencia conocida de su papel en la invasión, migración y formación de metástasis de las células tumorales pancreáticas, por lo que es interesante su estudio como posible diana terapéutica para este tipo de tumores.En este trabajo se ha puesto a punto un método de cribado de alto rendimiento (HTS) basado en los perfiles de desnaturalización térmica que he permitido el hallazgo de varios compuestos, de entre miles testados, que interaccionan con la proteína NUPR1. Los complejos resultantes, se han caracterizado biofísicamente utilizando técnicas como la calorimetría de titulación isoterma (ITC), la fluorescencia o la resonancia magnética nuclear (RMN), y se han aplicado técnicas de dinámica molecular y docking molelular para el estudio de los mismos. Posteriormente, para estudiar el efecto de los compuestos sobre las células tumorales pancreáticas, se han llevado a cabo diversos estudios celulares sobre líneas celulares, como estudios de ligación por proximidad (PLA: Proximity Ligation Assay), estudios de citotoxicidad, de cicatrización de heridas, o estudios de formación de colonias en soft-agar. Finalmente, para evaluar el efecto de los compuestos mas prometedores en un organismo mas complejo, se han llevado a cabo estudios en modelo animal de ratón.Los resultados sugieren la existencia de un compuesto capaz de modificar las propiedades pro-tumorales atribuidas a la proteína NUPR1 en las células tumorales pancreáticas, y con capacidad para modificar la progresión normal de un tumor de páncreas en un modelo animal, por lo que podría ser interesante su estudio como posible candidato para el tratamiento del adenocarcinoma ductal de páncreas.<br /

Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección

El creciente aumento de la incidencia de las infecciones bacterianas causadas por cepas resistentes a antibióticos ha estimulado la búsqueda de nuevos antimicrobianos que bloqueen vías metabólicas esenciales para la supervivencia de la bacteria, especialmente de aquellos procesos que resulten vitales en el contexto del proceso de infección. Para algunas bacterias, la respuesta a estrés oxidativo resulta esencial para lograr el éxito del proceso infeccioso, y por tanto constituyen dianas para posibles nuevos fármacos. En este Trabajo de Fin de Master vamos a estudiar los diversos mecanismos para hacer frente a la presencia de agentes tóxicos y/o de estrés oxidativo en el entorno de micobacterias. Para ello estudiaremos las micorredoxinas que junto con la presencia de micotiol constituyen la principal defensa frente al estrés oxidativo; Mycobacterium tuberculosis, posee tres genes denominados mrx1 (Rv3198A), mrx2 (Rv3053c), y mrx3 (Rv0508). El objetivo es construir los sustratos de intercambio alélico necesarios para construir mutantes knock-out de estos genes en BACs de E.coli

Cysteine mutational studies provide insight into a thiol-based redox switch mechanism of metal and DNA binding in FurA from Anabaena sp. PCC 7120

Aims: The ferric uptake regulator (Fur) is the main transcriptional regulator of genes involved in iron homeostasis in most prokaryotes. FurA from Anabaena sp. PCC 7120 contains five cysteine residues, four of them arranged in two redox-active CXXC motifs. The protein needs not only metal but also reducing conditions to remain fully active in vitro. Through a mutational study of the cysteine residues present in FurA, we have investigated their involvement in metal and DNA binding. Results: Residue C101 that belongs to a conserved CXXC motif plays an essential role in both metal and DNA binding activities in vitro. Substitution of C101 by serine impairs DNA and metal binding abilities of FurA. Isothermal titration calorimetry measurements show that the redox state of C101 is responsible for the protein ability to coordinate the metal corepressor. Moreover, the redox state of C101 varies with the presence or absence of C104 or C133, suggesting that the environments of these cysteines are mutually interdependent. Innovation: We propose that C101 is part of a thiol/disulfide redox switch that determines FurA ability to bind the metal corepressor. Conclusion: This mechanism supports a novel feature of a Fur protein that emerges as a regulator, which connects the response to changes in the intracellular redox state and iron management in cyanobacteria

Extracellular vesicles from Listeria monocytogenes-infected dendritic cells alert the innate immune response.

Communication through cell-cell contacts and extracellular vesicles (EVs) enables immune cells to coordinate their responses against diverse types of pathogens. The function exerted by EVs in this context depends on the proteins and nucleic acids loaded into EVs, which elicit specific responses involved in the resolution of infection. Several mechanisms control protein and nucleic acid loading into EVs; in this regard, acetylation has been described as a mechanism of cellular retention during protein sorting to exosomes. HDAC6 is a deacetylase involved in the control of cytoskeleton trafficking, organelle polarity and cell migration, defense against Listeria monocytogenes (Lm) infection and other immune related functions. Here, we show that the protein content of dendritic cells (DCs) and their secreted EVs (DEVs) vary during Lm infection, is enriched in proteins related to antiviral functions compared to non-infected cells and depends on HDAC6 expression. Analyses of the post-translational modifications revealed an alteration of the acetylation and ubiquitination profiles upon Lm infection both in DC lysates and DEVs. Functionally, EVs derived from infected DCs upregulate anti-pathogenic genes (e.g. inflammatory cytokines) in recipient immature DCs, which translated into protection from subsequent infection with vaccinia virus. Interestingly, absence of Listeriolysin O in Lm prevents DEVs from inducing this anti-viral state. In summary, these data underscore a new mechanism of communication between bacteria-infected DC during infection as they alert neighboring, uninfected DCs to promote antiviral responses.This study was supported by grant PDI-2020-120412RB-I00, PDC2021-121797-I00, BIO2015-67580-P and PGC2018-097019-BI00 from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO), grant S2017/BMD-3671-INFLAMUNE-CM from the Comunidad de Madrid, a grant from the Ramón Areces Foundation “Ciencias de la Vida y la Salud” (XIX Concurso-2018), “la Caixa” Banking Foundation (grants HR17-00016 and HR17-00247), BIOIMID (PIE13/041) and PRB3 (IPT17/0019 - ISCIII-SGEFI/ ERDF, ProteoRed) from Instituto de Salud Carlos III, CIBER Cardiovascular (CB16/11/00272), and Fondo de Investigación Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III and co-funding by Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER). IF-D is supported by a Fellowship from the Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities (FPU15/02539). DC-F is supported by a Fellowship from “la Caixa” Foundation (LCF/BQ/DR19/11740010). The CNIC is supported by the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) and the Pro CNIC Foundation, and is a Severo Ochoa Center of Excellence (CEX2020- 001041-S). Funding agencies did not intervene in the design of the studies, with no copyright over the study.S

DataSheet_1_Extracellular vesicles from Listeria monocytogenes-infected dendritic cells alert the innate immune response.pdf [Dataset]

Supplementary Figure 1. Isolated EVs present typical size and topology. Supplementary Figure 2. Protein profiling from total cell lysates and their derived EVs from WT and KO-HDAC6 BMDCs. Supplementary Figure 3. Enrichment in acetylated and ubiquitinated DC proteins upon Lm infection. Supplementary Figure 4. Ubiquitination in K-48 and K-63 state in T lymphoblast total cell lysates and their derived EVs. Supplementary Figure 5. Pore filtration methods restrain Lm and do not induce strong antipathogenic responses. Supplementary Figure 6. IFN-β is detected following Lm infection. Table S1. List of antibodies used for Western-blot and Flow Cytometry and the used dilution. Table S2. List of primers, with their corresponding sequence, used for qPCR. Table S3: Protein quantification in total cell lysates Table S4: IPA analysis of total cell lysates: canonical pathways and diseases and functions category Table S5: Protein quantification in EVs Table S6: IPA analysis of EVs: diseases and functions category Table S7: Ubiquitinated and acetylated peptides in total cell lysates and EVs Table S8: Enrichment analysis of ubiquitinated and acetylated proteinsPeer reviewe

DD04107-Derived neuronal exocytosis inhibitor peptides: Evidences for synaptotagmin-1 as a putative target

15 pags, 8 figs, 3 tabs. -- Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105231.The analgesic peptide DD04107 (Pal-EEMQRR-NH2) and its acetylated analogue inhibit α-calcitonin gene-related peptide (α-CGRP) exocytotic release from primary sensory neurons. Examining the crystal structure of the SNARE-Synaptotagmin-1(Syt1) complex, we hypothesized that these peptides could inhibit neuronal exocytosis by binding to Syt1, hampering at least partially its interaction with the SNARE complex. To address this hypothesis, we first interrogate the role of individual side-chains on the inhibition of α-CGRP release, finding that E1, M3, Q4 and R6 residues were crucial for activity. CD and NMR conformational analysis showed that linear peptides have tendency to adopt α-helical conformations, but the results with cyclic analogues indicated that this secondary structure is not needed for activity. Isothermal titration calorimetry (ITC) measurements demonstrate a direct interaction of some of these peptides with Syt1-C2B domain, but not with Syt7-C2B region, indicating selectivity. As expected for a compound able to inhibit α-CGRP release, cyclic peptide derivative Pal-E-cyclo[EMQK]R-NH2 showed potent in vivo analgesic activity, in a model of inflammatory pain. Molecular dynamics simulations provided a model consistent with KD values for the interaction of peptides with Syt1-C2B domain, and with their biological activity. Altogether, these results identify Syt1 as a potential new analgesic target.This work was supported by the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO-FEDER), RTI2018-097189-C2 and CTQ2017-84371-P), and the Spanish National Research Council (CSIC, 201880E109, 201980E030). The NMR experiments were performed in the “Manuel Rico” NMR laboratory, LMR, CSIC, a node of the Spanish Large-Scale National Facility ICTS R-LRB. We thank Prof. Josep Rizo and R. Voleti (Dept. Biophysics, Biochemistry and Pharmacology, UT Southwestern Medical Center, Dallas, USA) for providing the clones required for expressing Syt1 and Syt7 proteins. SG-R and AB belong to the Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA).Peer reviewe