Nuevas terapias en enfermedades neurodegenerativas de la motoneurona

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa, en la que resultan afectadas tanto las motoneuronas superiores como las inferiores, acabando con la muerte del enfermo dentro de los 3-5 años después de la aparición de los primeros síntomas. Hasta el momento no existe ningún tratamiento curativo frente a ella. El 5-Fluorouracilo (5-FU), quimioterápico ampliamente utilizado en el tratamiento del cáncer, ha demostrado en estudios previos en el modelo murino de ELA SOD1G93A una mejora significativa de la supervivencia y los síntomas motores. El objetivo general del presente trabajo es mejorar la aplicación terapéutica del 5-FU para la Esclerosis Lateral Amiotrófica, investigando su mecanismo de acción e incrementando su eficacia en los modelos animales de SOD1G93A. Los resultados de los estudios realizados muestran que el 5-FU produce una depleción de las células de la serie blanca y disminuye el número de agregados de proteína SOD1 mal plegada. Además, se ha observado que una pauta de administración continuada del 5-FU no modifica la supervivencia ni los síntomas motores de los animales

Estudio comparativo de dos métodos de aislamiento de exosomas en plasma humano para la búsqueda de biomarcadores en sarcopenia

La sarcopenia, la pérdida gradual y generalizada de la masa y función muscular con el envejecimiento, es uno de los principales problemas de salud en personas mayores, dada su alta prevalencia y enormes implicaciones clínicas y socioeconómicas.El plasma sanguíneo es una fuente mínimamente invasiva para descubrir biomarcadores de proteínas para el diagnóstico, seguimiento y evaluación de respuestas terapéuticas en enfermedades. Centrar el análisis en los exosomas, un subtipo de vesículas extracelulares (VE) contenidas en el plasma, es una nueva posibilidad de diagnóstico, que permite el análisis de biomarcadores proteicos a pesar de la complejidad del plasma. Un tamaño y morfología similar dificultan la diferenciación entre los exosomas y el resto de subtipos de VE y proteínas plasmáticas. La búsqueda de un método adecuado que permita una buena separación de los subtipos de VE supone un importante paso para la utilización de los mismos como biomarcadores.El objetivo de este trabajo fue poner a punto un método de extracción de exosomas de plasma humano con la mayor pureza posible basado en la Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC) para, en un futuro, estudiar su aplicación a la búsqueda de biomarcadores para la sarcopenia. Para ello, tras realizar dos métodos distintos, evaluamos las diferencias en la abundancia de proteínas y la contaminación de la muestra según la caracterización del proteoma por espectrometría de masas (MS) y su comparación con las bases de datos existentes.Los resultados muestran que la combinación de SEC con el uso de dos filtros podría mejorar significativamente la pureza y disminuir la contaminación en base al análisis del perfil proteómico de los exosomas derivados de plasma aislados por este método dada la disminución de contaminantes comunes, como las lipoproteínas y las cadenas de inmunoglobulinas.<br /

EFECTO DE UN TRATAMIENTO EXPERIMENTAL EN PROCESOS CELULARES ALTERADOS EN MODELOS ANIMALES DE ELA

La Esclerosis Lateral Amiotrófica es una enfermedad neurodegenerativa devastadora y sin tratamiento. Por ello, es de vital importancia el desarrollo de terapias que permitan, por lo menos, mejorar la calidad de vida de los pacientes. Resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado el efecto beneficioso del tratamiento con el quimioterápico 5-Fluorouracilo (5-FU) en el modelo murino de ELA SOD1G93A. En este contexto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Grado fue determinar si el efecto del tratamiento con dicho fármaco modificaba la expresión de genes implicados en alguno de los procesos patológicos de la enfermedad: autofagia, apoptosis e inflamación. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento con 5-FU no modula los procesos de autofagia ni apoptosis en el músculo esquelético de los animales modelos; y sugieren que la vía inflamatoria CCL2/CCR2 podría estar implicada en el mecanismo de acción del tratamiento con 5-FU

Estudio de la dinámica mitocondrial en el músculo esquelético de un modelo animal de Esclerosis Lateral Amiotrófica

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que provoca la pérdida progresiva de motoneuronas superiores e inferiores, conduciendo a la parálisis y atrofia muscular y, en última instancia, al fallecimiento del paciente. Aunque los mecanismos subyacentes no se comprenden completamente, se ha sugerido que la disfunción mitocondrial desempeña un papel crucial. Aunque numerosos estudios han investigado esta alteración en el sistema nervioso, se sabe menos acerca de cómo afecta esta disfunción a la fisiología del músculo esquelético.El objetivo de este trabajo es estudiar la dinámica mitocondrial en el músculo esquelético del modelo animal de ELA SOD1G93A, mecanismo que se encarga de mantener la morfología y funcionalidad de la red mitocondrial celular. Para ello, se estudió la expresión génica y proteica de las principales moléculas involucradas en los mecanismos de la dinámica mitocondrial. Además, se comprobaron a nivel transcriptómico la existencia de alteraciones musculares y mitocondriales en el músculo esquelético del modelo.Los resultados revelan una desregulación de la dinámica mitocondrial y mostraron una hiperactivación de las moléculas responsables de la fisión mitocondrial en el músculo esquelético del modelo de ELA SOD1G93A. Estos hallazgos sugieren que esta disfunción mitocondrial podría contribuir a la progresión de la enfermedad, empeorando la patogenia de la ELA. Además, plantean la posibilidad de que la dinámica mitocondrial pueda ser un objetivo terapéutico para el tratamiento de la enfermedad.<br /

Estudio de biomarcadores para diagnosticar y monitorizar la evolución de la sarcopenia

La sarcopenia es la pérdida gradual y generalizada de la masa y función de músculo esquelético con el envejecimiento. Es uno de los principales problemas de salud en personas mayores, dada su alta prevalencia y enormes implicaciones clínicas y socioeconómicas. El progresivo envejecimiento poblacional hace que la sarcopenia sea un problema de salud global cada vez mayor, más aún teniendo en cuenta su gran impacto económico en el consumo de atención médica debido a sus costes directos e indirectos.Actualmente se emplean técnicas como la Resonancia Magnética (RMN), la Tomografía Axial Computarizada (TAC), la Absorciometría Dual de Rayos X (DXA), el Análisis de Impedancia Bioeléctrica (BIA) y pruebas de función física, como la fuerza de agarre y la velocidad de la marcha para estimar la masa, fuerza y rendimiento muscular. Sin embargo, estas pruebas solo son operativos tras el inicio o la progresión de la enfermedad. Además, los aparatos necesarios y las personas formadas para usarlos suelen encontrarse en hospitales y grandes centros médicos, por lo que estos métodos no son prácticos para su uso en los centros de salud o residencias, donde se encuentran la mayoría de los pacientes sarcopénicos.Por ello, es necesario desarrollar nuevos métodos diagnósticos para la enfermedad que sean sensibles, específicos y de fácil realización y medición en centros de salud pequeños o residencias, que no necesiten personal ni infraestructuras muy especializadas y costosas. En este trabajo se exponen distintos biomarcadores moleculares que podrían conformar un panel múltiple y proporcionar un nuevo método diagnóstico para la identificación precoz de la sarcopenia en la práctica clínica habitual. Se espera que con este nuevo método diagnóstico, los profesionales tengan más posibilidades de prevenir, retrasar, tratar y, a veces, incluso revertir la sarcopenia a través de intervenciones tempranas y efectivas.<br /

Implicación de la inflamación en la Esclerosis Lateral Amiotrófica: identificación de biomarcadores y dianas terapéuticas

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la motoneurona superior, situada en el córtex motor, y a la motoneurona inferior, situada en el asta anterior de la médula espinal. La pérdida progresiva de motoneuronas conlleva una parálisis y atrofia muscular que desencadena el fallecimiento del paciente en un periodo promedio de 3 a 5 años tras el inicio de los síntomas, generalmente debido a un fallo respiratorio. Actualmente los únicos tratamientos que existen son paliativos, y, en la mayoría de los casos, se desconocen las causas que provocan esta enfermedad. No obstante, se han estudiado numerosos mecanismos moleculares que se han visto implicados en la patogenia de la ELA, entre ellos la inflamación. Este mecanismo está caracterizado por la activación de la microglía, astrogliosis, infiltración de los linfocitos T y monocitos, y una superproducción de citoquinas inflamatorias que conlleva a un daño progresivo en la motoneurona, contribuyendo a la progresión de la enfermedad.El objetivo general de la presente memoria de Tesis Doctoral fue estudiar el papel de la inflamación en la ELA mediante la identificación de biomarcadores y dianas terapéuticas con el fin de trasladarlos finalmente a la práctica clínica. Para ello, en primer lugar, se estudió un panel de 97 citoquinas en plasma de animales SOD1G93A presintomáticos con el fin de identificar aquellas citoquinas cuya expresión pudiera estar alterada y que además pudieran servir de ayuda al diagnóstico. Los resultados mostraron que los niveles de 16 citoquinas estaban modificados en el modelo animal con respecto a sus controles, indicando que existe una desregulación del sistema inmune en una fase temprana de la enfermedad. A continuación, se estudió la capacidad pronóstica de dichas citoquinas correlacionando sus niveles en sangre en diferentes estadios con la supervivencia de los animales SOD1G93A. A pesar de que se observó una mayor expresión de estas citoquinas en los animales que mostraron una menor supervivencia, no se pudo identificar ninguna proteína como biomarcador pronóstico debido a su gran variabilidad en sangre. Por este motivo se eligió una de las citoquinas que había mostrado una mayor correlación, la IL-6, para estudiarla en los tejidos más afectados por la enfermedad, en concreto en la médula espinal y músculo esquelético del modelo animal SOD1G93A; además, se investigó su papel como biomarcador en sangre de pacientes de ELA. Se observó un incremento en la expresión de IL-6 en los animales modelo frente a sus controles a partir del estadio sintomático temprano en el músculo extensor digital largo, que es un músculo con predominio de fibras de contracción rápida las cuales se encuentran más dañadas por la enfermedad. Estos resultados sugieren el estudio de dicha proteína como biomarcador en músculo esquelético con predominio de fibras de contracción rápida en el modelo animal, y, en un futuro, en pacientes. Posteriormente, se investigó la modificación de las citoquinas sanguíneas desreguladas y otras proteínas relacionadas con la inflamación tras la aplicación de un tratamiento neuroprotector basado en el fragmento C de la toxina tetánica (TTC) en el modelo animal SOD1G93A para analizar la capacidad predictiva de marcadores inflamatorios para su utilización en ensayos clínicos. Los resultados mostraron una disminución en la expresión de IL-6 en plasma, médula espinal y músculo esquelético de los animales tratados con TTC, indicando que dicha proteína podría tener un papel predictivo en la enfermedad. Finalmente, se evaluó el papel de marcadores inflamatorios como dianas terapéuticas en ELA. Para ello, nos centramos en el efecto de la reducción de los niveles génicos de granzima A (gzmA), implicada en procesos pro-inflamatorios, sobre la supervivencia de los animales SOD1G93A. Los resultados mostraron que los ratones SOD1G93A heterocigotos (gzmA +/-), donde encontramos una menor expresión de gmzA, IL-1β y GSR, vivieron más que los ratones SOD1G93A homocigotos gzmA +/+. Esto confirmó que el aumento de la supervivencia estaba asociada a una menor expresión de este gen pero no a su ausencia, ya que los animales SOD1G93A homocigotos (gzmA -/-) no mostraron una supervivencia mayor con respecto a los controles. Por tanto, estos resultados indicaron que una reducción intermedia de los niveles de gzmA puede favorecer una progresión más lenta de la enfermedad en este modelo animal.En conclusión, la alteración mostrada en diversas citoquinas pro-inflamatorias en el modelo animal SOD1G93A desde estadios tempranos hasta estadios terminales resulta ser muy variable, lo que dificulta su papel como biomarcadores de la enfermedad. No obstante, dicha alteración se presenta como una futura diana terapéutica para la esclerosis lateral amiotrófica.<br /

Alteración de la autofagia y su modulación por una dieta rica en lípidos en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una afectación y pérdida selectiva de las motoneuronas y por una progresiva debilidad muscular. Los mecanismos fisiopatológicos causantes de esta enfermedad no se conocen todavía, pero en los últimos años, entre las muchas teorías propuestas, se postula que la acumulación de proteínas anormalmente plegadas podría estar relacionada con el desarrollo de la enfermedad. Los dos principales mecanismos que participan en la proteostasis celular son la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), y ambos procesos pueden ser esenciales para la reducción de la toxicidad mediada por la proteína SOD1 mutada. En esta Tesis Doctoral se han estudiado los procesos de degradación proteica mediada por la autofagia y por el proteasoma, así como los procesos de muerte celular programada a lo largo de la enfermedad en el músculo esquelético y la médula espinal en el modelo murino SOD1G93A. En un primer lugar, para eliminar el sesgo por el efecto del género en los procedimientos experimentales, se determinaron las diferencias existentes entre machos y hembras en la autofagia constitutiva en el músculo esquelético y la médula espinal de ratones wild type. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los marcadores de autofagia objeto de estudio (LC3 y p62) entre ambos sexos, y además estas diferencias son específicas del tejido estudiado. Después de confirmar la necesidad de incluir grupos experimentales balanceados para el sexo, se ha estudiado la activación de la autofagia y el proteasoma en el músculo esquelético de los ratones modelo a lo largo de la enfermedad. Los datos obtenidos indican una alteración en la actividad del proteasoma en los estadios estudiados y un aumento de la autofagia en el estadio terminal de la enfermedad. Además el análisis del proceso de muerte celular por apoptosis, indica que no se producen una activación significativa de la misma en la progresión de la enfermedad. Por otra parte, se han comparado distintas pruebas de comportamiento para conocer cuál de ellas es la más adecuada para poder evaluar el efecto de un posible tratamiento en nuestros ratones modelo. Los resultados obtenidos muestran que tanto el test de rotarod como de la rejilla, son las pruebas más sensibles para detectar fallos tempranos en el comportamiento motor de los ratones, y además estas pruebas permiten realizar una adecuada caracterización del comportamiento motor de dichos animales. Posteriormente, se realizó un ensayo pre-clínico consistente en la administración de una dieta enriquecida en lípidos, concretamente con aceite de oliva extra virgen y con aceite de palma, en los ratones modelo. La ingestión de la dieta enriquecida con aceite de oliva extra virgen mejora el comportamiento motor y aumenta la supervivencia de los animales, además de mejorar el estado del músculo como lo evidencia el aumento del grosor de las fibras. Tal y como esperábamos, esta dieta produce una mejora de los indicadores moleculares de la autofagia y de los parámetros asociados al estrés del retículo endoplasmático y al daño muscular en el estadio terminal de la enfermedad. Finalmente, puesto que los procesos de muerte celular programada han sido ampliamente estudiados en la médula espinal, pero no los procesos de degradación proteica, se ha llevado a cabo el estudio de los mismos en dicho tejido. El análisis de estos mecanismos a lo largo de la enfermedad en el modelo animal indica que la autofagia no tiene un papel tan relevante como en el músculo esquelético, y el proteasoma se encuentra activado sólo en estadios terminales de la enfermedad. Las alteraciones observadas en los procesos de degradación proteica objeto de estudio a lo largo de la enfermedad se presentan como una posible diana terapéutica, tal como se ha demostrado con la administración de una dieta enriquecida con aceite de oliva extra virgen

Mecanismo de acción del fármaco 5-Fluorouracilo y su efectividad como tratamiento en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica.

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una afectación selectiva y pérdida progresiva de las motoneuronas que inervan los músculos estriados. La pérdida de motoneuronas conlleva una parálisis, debilidad y atrofia muscular que desencadena la muerte del paciente en un promedio de 3 a 5 años tras el inicio de los síntomas. La etiología de la ELA no está clara y se han sugerido numerosos mecanismos moleculares implicados en la patogenia, entre ellos la neuroinflamación. Algunos de los mediadores de este proceso neuroinflamatorio son unos complejos proteicos citosólicos conocidos como inflamasomas, siendo el inflamasoma NLRP3 el mejor caracterizado. Otros mediadores que podrían tener un papel fundamental son los microRNAs (miRNAs) ya que son reguladores de multitud de procesos fisiológicos. Actualmente no existe un tratamiento curativo o que ralentice de forma efectiva la progresión de la enfermedad, por tanto, la búsqueda de tratamientos constituye uno de los objetivos primordiales de la investigación de esta enfermedad. El reposicionamiento de fármacos, uso de un medicamento ya autorizado para tratar una patología que puede ser potencialmente eficaz para tratar otras enfermedades, es una buena estrategia para enfermedades tan devastadoras y rápidas como la ELA. Estudios previos de nuestro laboratorio con el quimioterápico 5-Fluorouracilo (5-FU) mostraron unos resultados prometedores en el modelo animal SOD1G93A ya que retrasó la aparición de la enfermedad, mejoró el comportamiento motor y prolongó la supervivencia de los animales. Sin embargo, el mecanismo de acción del 5-FU en la ELA es desconocido. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue conocer en profundidad las posibilidades del 5-FU como tratamiento y conocer el mecanismo de acción por el que este efecto tenía lugar, utilizando para este fin el modelo animal de Esclerosis Lateral Amiotrófica SOD1G93A. Respecto al mecanismo de acción, en primer lugar, se estudió el inflamasoma NLRP3 en cuádriceps y médula espinal de ratones SOD1G93A a lo largo de la enfermedad y el efecto del fármaco en ellos. Los resultados mostraron un posible efecto del 5-FU sobre el inflamasoma en la etapa final. Posteriormente, se investigó la expresión de diferentes miRNAs implicados en el proceso inflamatorio en cuádriceps y médula espinal del modelo animal a lo largo de la enfermedad. Sin embargo, no se observó un claro efecto del 5-FU sobre la expresión de los miRNAs. Por otro lado, también se estudió la toxicidad y eficacia en el ratón SOD1G93A de Capecitabina, profármaco del 5-FU, ya que presenta una eficacia similar y efectos secundarios más leves. Aunque los resultados no mostraron efectos adversos, no se continuó investigando su eficacia debido al problema que podría suponer su administración en los enfermos terminales. Asimismo, se estudió la biodisponibilidad del 5-FU demostrando que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Con el fin de evitar en el mayor grado posible los efectos secundarios que produce el 5-FU, se estudió la posibilidad de encontrar una dosis menor que mostrara la misma efectividad que la original, así como una mayor dosis que incrementara los efectos beneficiosos. Para ello, se realizó un estudio piloto de efectividad con distintas dosis. Los resultados indicaron que una dosis menor que la original podría resultar más efectiva. En consecuencia, se realizó un ensayo preclínico completo para estudiar en profundidad la efectividad de la nueva dosis y sorprendentemente, los resultados mostraron que la nueva dosis estudiada no era efectiva en el modelo animal. Por ello, nos planteamos la posibilidad de que hubiera algo en el ambiente que pudiera estar modificando la respuesta al fármaco, ya que los animales provenían de un ambiente distinto al del estudio original. Para comprobar dicha teoría, se realizó un estudio de supervivencia con grupos de animales que provenían de diferentes ambientes. Los resultados mostraron diferencias en cuanto a la efectividad del 5-FU en las distintas condiciones experimentales.En conclusión, el inflamasoma NLP3 parece estar modulado de forma leve por la acción del 5-FU en el modelo SOD1G93A, no observando los mismos resultados en la expresión de los miRNAs relacionados con la enfermedad. Por otra parte, el fármaco muestra un efecto beneficioso en el modelo animal SOD1G93A en unas condiciones ambientales concretas. Las condiciones ambientales parecen tener mucha influencia en el animal SOD1G93A y en la respuesta al 5-FU. Estos resultados indican que es necesario comprobar distintas condiciones ambientales antes de proponer una posible terapia efectiva para los pacientes de ELA con la utilización de los modelos animales de ELA SOD1G93A.<br /

Efecto de polimorfismos genéticos en la producción de leche del ganado Siboney de Cuba

El objetivo de este estudio fue estimar los componentes de varianza, los parámetros genéticos y el efecto individual de ocho polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) en los genes correspondientes [αS1-caseína (CASA1), β-caseína (BCAS), αS2-caseína (CASA2), κ-caseína (KCAS), α-lactoalbúmina (LAA), β-lactoglobulina (LAG), hormona de crecimiento (GH) y prolactina (PRL)], sobre la producción de leche a los 305 días de lactancia en la raza Siboney de Cuba. Se analizaron 1904 registros de lactancias de 913 vacas procedentes de 17 vaquerías, bajo un modelo de repetibilidad. A través de la técnica de minisecuenciación se determinó el polimorfismo en los genes. Los ocho loci estudiados tuvieron un comportamiento polimórfico. Los coeficientes de heredabilidad y repetibilidad estimados para la producción de leche a los 305 días fueron de 0,12 y 0,33. Los loci LAG (p≤0,05) y PRL (p≤0,10) tuvieron un efecto significativo en la producción de leche. Los valores de heredabilidad y la repetibilidad para la producción de leche a los 305 días fueron moderados, lo que indica que es posible obtener una respuesta positiva a la selección en esta población. La selección para los genotipos LAGAA y PRLBB resultará en vacas que tengan una mayor producción de leche

Nueva estrategia para una futura terapia génica en enfermedades neurodegenerativas de la motoneurona: Producción y estudio funcional de factores neurotróficos fusionados al fragmento C de la tóxina tetánica

El objetivo particular del presente trabajo se encuentra en el objetivo general del desarrollo de nuevos tratamientos, basados en terapia génica para las enfermedades de la motoneurona, particularmente la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Estas estrategias están basadas en el transporte específico del fragmento C de la toxina tetánica (TTC), hacia las motoneuronas, de sustancias antiapoptóticas. En el presente trabajo, se han producido las fusiones genéticas de los factores neurotróficos (GDNF y BDNF) y el fragmento C de la toxina tetánica. El efecto sobre la supervivencia neuronal de las proteínas de fusión GDNF-TTC y BDNF–TTC se estudió en la línea Neuro 2A. Los resultados mostraron que ambas moléculas presentaban una disminución de la apoptosis de estas células cuando se encontraban en estado de degeneración. Ambas moléculas activan la quinasa Akt, relacionada con la supervivencia celular y más específicamente localizada en el núcleo. Por último, un efecto antiapoptótico del fragmento C de la toxina tetánica fue observado. Estos resultados demuestran que las moléculas GDNF-TTC y BDNF-TTC son funcionales, inhibiendo la apoptosis neuronal