A gyermekjogi egyezmény 3. cikk 1. bekezdésének értelmezési és alkalmazási nehézségei

A gyermeki jogok területén munkálkodók és a laikusok számára egyaránt isme- rős a „gyermek legfőbb érdeke” kifejezés. Ez a sokat hangoztatott elv az ENSZ Gyermekjogi Egyezményének (a továbbiakban: „Egyezmény”) egyik alapelve, amely mára a gyermekekről való gondolkodás kiindulópontja, és annak garanciája, hogy a gyermeki jogok megfelelő módon valósuljanak meg a részes államok gya- korlatában. A jelen cikk célja a „ the best interests principle ” vagyis az Egyezmény 3. cikk (1) bekezdésének bemutatása és elemzése, jelentőségének feltárása. Habár terjedelmes nemzetközi irodalom foglalkozik a „legfőbb érdek” alapelv hatékony- ságával és alkalmazásának nehézségeivel, a hazai irodalom a mai napig adós ha- sonló elemzéssel. A cikk ezt a rést igyekszik kipótolni

Miozin motorfehérjék: szerkezet-funkció összefüggések és funkcionális vizsgálatok idegsejteken = Myosin motor proteins: structure-function relationship and functional studies in neurons

Kutatómunkánk elsődlegesen a miozin motorfehérjék szerkezet-funkció vizsgálatára irányult. Meghatároztuk a konvencionális miozin (miozin-II) fej szerkezetét az enzimatikus ciklus egy ez idáig nem ismert állapotában. A szerkezet rávilágított a kémiai energiát munkává alakító „négyütemű” motor működésének több kulcsfontosságú elemére. Azonosítottunk a motor doménen belül egy kölcsönhatást, amely hozzájárulhat a különböző miozinok optimális működéséhez. Kiderítettük, hogy a fej-farok kapcsolódás instabil szerkezetű a közvetlenül szabályozott miozin-II motoroknál. A miozin-VI farok régiójáról megmutattuk, hogy egyszálú ?-hélix (CSAH) szerkezetű. Új szerkezetjósló programokkal megállapítottuk, hogy a CSAH egy eddig fel nem ismert, sok fehérjében megtalálható szerkezeti elem, amely mechanikai szerepet tölthet be. A miozin-V intracelluláris transzport folyamatokban betöltött szerepét élő idegsejteken kezdtük el vizsgálni. A miozin-V farok könnyű lánc (DYNLL) kötőhelyét azonosítottuk a nehéz láncon belül. Kimutattuk, hogy a DYNLL egy konzervatív ún. csomóponti fehérje, amely a kölcsönható fehérjék szerkezet nélküli régiójában elhelyezkedő lineáris motívumokhoz kötődik és így szabályozza őket. Jellemeztük a DYNLL-partner komplexek kialakulásának termodinamikáját és kinetikáját. Irányított evolúció segítségével az eddig ismerteknél erősebb kötőszekvenciát állítottunk elő, s bioinformatikai módszerrel további potenciális partnerfehérjéket azonosítottunk a humán proteomban. | We have primarily pursued structure-function studies of myosin motor proteins. We have determined the 3-dimensional structure of conventional myosin (myosin II) in one state of its enzymatic cycle. The structure highlighted some of the key elements during the chemo-mechanical energy transduction of the “4-stroke” motor. We have identified an interaction within the motor domain of which could contribute to the optimal functioning of different myosins. Comparative studies revealed that the structure of the coiled-coil tail at the head-tail junction is unstable in directly regulated myosin IIs. We have shown that the tail region of myosin VI forms a single ?-helix (CSAH). Using newly developed prediction programs we have found that CSAH is a novel structural motif present in a many proteins and that it could play mechanical roles. We have started to investigate the role of myosin V in intracellular transport of neuronal cells by live-cell imaging. We have localized the binding site of the tail light chain (DYNLL) of myosin V. DYNLL was identified as a conserved hub protein that binds to linear motifs localized in disordered regions of their binding partners and hence regulate them. We have determined the thermodynamic and kinetic properties of DYNLL-partner complexes. Using directed evolution we have selected a stronger DYNLL binding peptide than previously known ones, and we have predicted potentially novel binding partners in the human proteome

A fehérje-fehérje kölcsönhatások szerkezeti alapjai és biológiai szerepük: multidiszciplináris megközelítés = The structural basis and biological role of protein-protein interactions: a multidisciplinary approach

Az ELTE Biokémiai Tanszék tudományos kutatásainak tengelyében évtizedek óta a fehérjék szerkezetének, funkciójának és a fehérjék közötti kölcsönhatások szerkezeti hátterének és biológiai jelentőségének felderítése áll. Valamennyi, az elmúlt négyéves pályázati ciklusban vállalt feladatunk teljesítése a fenti célokat szolgálta. A vezető kutató megítélése szerint a pályázat támogatásával elért legkiemelkedőbb eredményeink, a vállalt témák sorrendjében a következők voltak: 1) Megállapítottuk, hogy a primata-specifikus tripszin 4 egyik, feltehetően biológiai szubsztrátja a mielin bázikus fehérje és modellt dolgoztunk ki a humán tripszinogén 4 asztroglia sejteken belüli transzportjának és aktivációjának követésére 2) Hazánkban elsőként állítottuk be a fágbemutatás módszerét, melynek segítségével az eredetitől eltérő specifitású proteáz inhibitorokat állítottunk elő. 3) Megállapítottuk, hogy a miozin II motorfehérje regulációs képességének az az előfeltétele, hogy aproximális kétláncú coiled-coil szerkezet instabil legyen. 4) Felderítettük a miozin II specifikus inhibitorának, a blebbistatinnak a működésmechanizmusát. 5) Kifejlesztettünk egy új tranziens kinetikai módszert, a ?temperature-jump/stopped flow-t a módszer alkalmazásához szükséges berendezéssel együtt. | For decades the focus of scientific interest of the Biochemistry Department, Eötvös Loránd University, Budapest has been the investigation of the structural basis and biological significance of protein-protein interactions. Our research efforts during the last 4 years were to achieve specific goals along this line. In the view of the principal investigator of this grant the most outstanding scientific results achieved, or discoveries made by using the financial means of the grant are as follows: 1) We provided indirect evidence that one of the potential pathological substrate of human trypsin 4 might be myelin basic protein. Furthermore, we worked out a model to follow the transport and activation of human trypsinogen 4 within human astroglia cells. 2) For the first time in Hungary we introduced the methodology of phage-display in our department and by using this method we succeeded in producing serine protease inhibitors with altered specificity. 3) Evidence was provided that the instability of the proximal two-chain coiled structure in myosin II plays an important regulatory role in the myosin functioning 4) The mechanism of action of the inhibitor of myosin II, blebbistatin was explored. 5) We developed and set up a new method and apparatus to perform ?temperature-jump/stopped flow? transient kinetics experiments

Szerkezeti biológia = Structural biology

Kiroptikai spektroszkópia (ECD, VCD) - Az abszolút konfiguráció meghatározása - Gyűrűs és lineáris peptid modellek konformációjának meghatározása - Királis diródium komplexek ECD és VCD vizsgálata Fehérje NMR és modellezés - Peptidek számitástechnikai vizsgálata - Fehérjék NMR vizsgálata Fehérje röntgenkrisztallográfia - Egy prolil-oligopeptidáz (POP) komplexei kristályszerkezetének meghatározása - A kalmodulin (CaM) vizsgálata - A molekuláris felismerés szerkezeti vonatkozásai - A Pyrococcus horikoshii acilamino-peptidáz (AAP) kristályszerkezetének meghatározása Biokémiai vizsgálatok - A scallop-peptid vizsgálata három kristályközegben - A miozin-6 utolsó (tail) doménje szerkezetének predikciója - A coiled-coil és rendezetlen fehérje szegmensek kereszt-predikciójának analízise - Öt természetes és két szintetikus, töltéssel rendelkező ?-hélix lánc mikroszekundum időskálájú molekuladinamikai szimulációja vizes közegben - Az LC8 dynein centrális (hub) fehérje könnyű láncának (DYNLL) vizsgálata Immunológiai vizsgálatok - Az SHP-2 tirozin-foszfatáz vizsgálata. Különböző szerkezetű foszfopeptidek tanulmányozása - Egy biotinilezett kollagén epitóp peptid, az extravidin-peptid complex és extravidin szerkezetvizsgálata Közlemény: 36 | Chiroptical spectroscopy (ECD, VCD) - Determination of the absolute configuration - Determination of the conformation of cyclic and linear model peptides - Studies on the chiral dirhodium complexes by ECD and VCD Protein NMR and protein modeling - Computational work on peptides. - NMR studies in proteins Protein X-ray crystallography - The crystal structures of prolyl oligopeptidase (POP) in complexes were solved. - Studies on calmodulin (CaM). - Structural aspects of molecular recognition were characterized. - The crystal structure of Pyrococcus horikoshii acylaminoacyl peptidase was solved. Biochemical studies - The structure of a scallop peptide in three crystal environments was determined . - The structure of the tail domain of myosin-6 was predicted. - A thorough analysis of cross-predictions of coiled-coil and disordered protein segments was performed. - Microsecond classical molecular dynamics simulations of five naturally occurring and two synthetic charged single ?-helices were performed. - Studies on LC8 dynein light chain (DYNLL), a hub protein. Immunological studies - Studies on SHP-2 tyrosine phosphatase. A variety of phosphopeptides were tested. - Structural studies were performed on biotinylated collagen epitope peptide, an extravidin-peptide complex and extravidin. Papers: 3

Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway

<div><p>Protein-protein interactions (PPIs) formed between short linear motifs and globular domains play important roles in many regulatory and signaling processes but are highly underrepresented in current protein-protein interaction databases. These types of interactions are usually characterized by a specific binding motif that captures the key amino acids shared among the interaction partners. However, the computational proteome-level identification of interaction partners based on the known motif is hindered by the huge number of randomly occurring matches from which biologically relevant motif hits need to be extracted. In this work, we established a novel bioinformatic filtering protocol to efficiently explore interaction network of a hub protein. We introduced a novel measure that enabled the optimization of the elements and parameter settings of the pipeline which was built from multiple sequence-based prediction methods. In addition, data collected from PPI databases and evolutionary analyses were also incorporated to further increase the biological relevance of the identified motif hits. The approach was applied to the dynein light chain LC8, a ubiquitous eukaryotic hub protein that has been suggested to be involved in motor-related functions as well as promoting the dimerization of various proteins by recognizing linear motifs in its partners. From the list of putative binding motifs collected by our protocol, several novel peptides were experimentally verified to bind LC8. Altogether 71 potential new motif instances were identified. The expanded list of LC8 binding partners revealed the evolutionary plasticity of binding partners despite the highly conserved binding interface. In addition, it also highlighted a novel, conserved function of LC8 in the upstream regulation of the Hippo signaling pathway. Beyond the LC8 system, our work also provides general guidelines that can be applied to explore the interaction network of other linear motif binding proteins or protein domains.</p></div

GO enrichment in the high confidence set of LC8 binding partners.

<p>Molecular Function (blue), Biological Process (green) and Cellular Component (red) categories that are enriched in the high-confident LC8 binding partners compared to human background. The x-axis represents the log-odds ratio of each enriched GO category. Process names related to the Hippo pathway are colored in red.</p

Filtering protocol to find true binding partners.

<p>(A) Schematic diagram of the binary filtering protocol we created utilizing information gain. A given attribute provides a binary split of the Parent group into the <i>C1</i> and <i>C2</i> child groups. The information gain (<i>I</i>) is then calculated as the difference of the Shannon entropy (<i>H</i>) of the Parent group minus the Shannon entropy of the Children groups weighted by their relative probabilities (<i>p</i>). These values were calculated over the dataset containing 40 known human binding partners and 10,000 random human segments from the proteome with a higher than zero PSSM score. (B) The information gain of the PSSM score (left panel) and four disorder prediction methods as a function of different cut-off values (right panel). The disorder prediction method used here were: IUPred (blue), Espritz Disprot (green) and VSL2 (red line), DISOPRED3 (cyan). Optimal cut-off values were obtained from the cut-off value corresponding to the maximum of the information gain, yielding 3.3 for the PSSM score, and 0.42 for IUPred disorder prediction score. (C) The outline of the final filtering protocol indicating the number of elements and percentage of cases in each Child group with the applied binary split.</p

Experimentally validated LC8 binding motifs in the Hippo pathway.

<p>Experimentally validated LC8 binding motifs in the Hippo pathway.</p