Interaction between isothiocyanates and cytochromes P450: a computational docking study

Dissertação de mestrado, Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro,Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016Cancer is the second leading cause of death worldwide. Environmental and lifestyle factors play a crucial role in its development. Certain components of the diet, namely Isothiocyanates (ITCs), which are present in cruciferous vegetables, can act as cancer chemoprevention agents, which may reduce cancer development risk up to 50%. ITCs are thought to act through inhibition of Phase I biotransformation enzymes, cytochromes P450 (CYPs), which are responsible for the bioactivation of many pre-carcinogenic compounds in the body. In this study we used computational (in silico) docking methods to investigate the interaction between ITCs and several important members of the CYP family who are known to be inhibited by this group of chemopreventive agents. Experimental inhibition constants (Ki) were compared with the estimates produce with the in silico docking algorithms. In silico docking was performed using several ITCs (BITC, PEITC, PHITC, PPITC) as ligands and all the CYP files available in the PDB website for the following receptor molecules: CYP2A6, 2A13, 2B6, and 2C9. In order to investigate how different docking algorithms and scoring functions would affect the docking results, the softwares Autodock Vina (Vina) and AutoDock4 (AD4) were both used and compared to other results found in the literature. The relative performance of AD4 and Vina was assessed by in silico redocking the crystallographic ligands of the studied CYPs and comparing the results with the experimentally observed conformations The best docked ligand structure found by both programs is, for most cases, very similar in position and conformation to the crystallographic structure, with Vina producing Ki values in closest agreement with experimental data. In terms of both rigid and flexible docking, Vina produced better results with more accurate Ki values when compared with AD4. Vina is better at flexible while AD4 is better at rigid docking. The docking of a ligand to its crystallographic partner as compared with docking to a different structure of the same CYP generally yields the second best Ki values. ITCs were found to be good inhibitors of CYP2A6 and PHITC is a very good inhibitor of CYP2A13. High Ki values corresponding to weak inhibition were observed for CYP2B6, whereas very poor inhibition was observed for CYP2C9.O cancro é considerado a segunda causa de morte em todo o mundo. Os factores ambientais e o estilo de vida desempenham um papel crucial no desenvolvimento desta doença. Muitos estudos epidemiológicos mostram que uma dieta rica em frutas e vegetais é capaz de levar a uma diminuição do risco de se desenvolver cancro até 50%. Um dos elementos de uma dieta saudável que tem um papel especialmente relevante na prevenção do cancro são os vegetais crucíferos. Estes contêm compostos chamados glucosinolatos. Quando os glucosinolatos entram em contacto com a enzima mirosinase há a produção maioritária de isotiocianatos. Os glucosinolatos conseguem prevenir o aparecimento e desenvolvimento de cancro através da regulação de vários mecanismos celulares, sendo de especial relevância a regulação do metabolismo de compostos xenobióticos pelas enzimas de biotransformação. Os isotiocianatos conseguem activar as enzimas de Fase II (destoxificação – conjugação) e inibir as enzimas de Fase I (destoxificação e bioactivação de carcinogénios – oxidação). Os citocromos P450 (CYPs) são os enzimas responsáveis pela maioria (70-80%) do metabolismo da Fase I. Estas versáteis monooxigenases são capazes de hidroxilar muitos compostos e estão presentes em maior abundância no retículo endoplasmático liso dos hepatócitos. As principais famílias de CYPs responsáveis pela carcinogénese são também aquelas que estão envolvidas no metabolismo de compostos exógenos (CYP1-2). Os ITCs conseguem inibir, de forma reversível ou irreversível, a actividade catalítica de alguns CYPs, ligando-se ao centro activo destes enzimas. O tempo de vida dos ITCs no organismo está dependente da actividade dos enzimas de Fase II. Estes são activados pelos ITCs, levando à sua posterior degradação pela via do ácido mercaptúrico e posterior excreção por via urinária (principal via) ou fecal. Uma miríade de ITCs de origem natural e sintética são capazes de inibir a actividade dos CYPs. Após uma revisão da literatura disponível, foram escolhidos 4 ITCs [benzil-ITC (BITC); fenetil-ITC (PEITC); 6-fenilhexil-ITC (PHITC); 3-fenilpropil-ITC (PPITC)] e 4 CYPs (2A6; 2A13; 2B6; 2C9) para serem objecto de estudo nesta tese de mestrado. A modelação molecular tem vindo a ganhar um maior destaque nos últimos anos devido à maior velocidade de processamento de dados por computadores pessoais. Neste tipo de estudos é necessário considerar diversos factores, tais como o tamanho e as propriedades electrónicas das moléculas. Várias abordagens teóricas e algoritmos de modelação podem ser usados quando se faz acoplamento (docking) molecular. O método de ab initio tenta resolver a equação de Schrödinger através do uso da aproximação de Born–Oppenheimer assumindo o movimento dos núcleos e desprezando o movimento dos electrões. Por sua vez, o método de mecânica molecular tira partido das forças existentes entre as ligações atómicas numa molécula. Finalmente, o método de dinâmica molecular tenta resolver as equações Newton aplicadas ao movimento de moléculas. Para os cálculos de docking molecular deste trabalho, utilizaram-se dois programas: AutoDock Vina (Vina) e AutoDock 4 (AD4). Em ambos os caos é usada uma função de pontuação (scoring) e um algoritmo de busca, de modo a tentar encontrat a conformação ideal de acoplamento de ligando e receptor. No entanto, os dois programas diferem na forma matemática da função de scoring e no mecanismo do algoritmo de pesquisa. Os ITCs foram construídos utilizando o programa HyperChem, o qual providencia as ferramentas necessárias à criação de modelos moleculares num ambiente tridimensional. O processo de construção das moléculas envolve cálculos de mecânica quântica (ab initio) bem como de mecânica molecular (utilizando o campo de forças MM+), podendo os modelos gerados ser usados em diversos tipo de simulações moleculares. Este tipo de métodos permite prever o modo como a estrutura das moléculas simuladas responde a diversos tipos de perturbações. Foi realizado o download dos ficheiros pdb dos CYPs de origem humana a partir do website do Protein Data Bank (PDB), o qual consiste numa grande base de dados para estruturas cristalográficas de macromoléculas biológicas e dos seus respectivos ligandos (quando presentes). A maioria destas estruturas foi obtida experimentalmente por cristalografia de raio-X, e em menor número por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR). A primeira técnica de determinação de estrutura molecular baseia-se no uso de raios X que são incididos sobre um cristal da molécula cuja estrutura se pretende determinar levando à produção de padrões de difracção que podem ser usados para resolver a estrutura molecular. A segunda técnica baseia-se na exposição da molécula em estudo a um campo magnético extremamente forte, o qual vai produzir a reorientação do spin nuclear de alguns tipos de átomos presentes na amostra, possibilitando assim a sua determinação estrutural. O acoplamento molecular dos CYPs com os respectivos ligandos nativos bem como com os ITCs foi realizado através do uso do conjunto de programas AutoDock Tools (ADT), AutoGrid4/AutoDock4 (AD4) e AutoDock Vina (Vina). É através do emprego destes programas que se procurou encontrar a melhor energia de interação possível entre ligando e receptor. Esta tarefa é realizada através do uso de funções de scoring, as quais fornecem uma previsão da afinidade de ligação entre ligando e receptor, bem como da orientação e conformação relativa das duas moléculas. Aminimização de scoring é usada como objectivo na busca sistemática pela melhor conformação do ligando (flexível) no receptor (rígido ou flexível). Os ficheiros pdb contendo as estruturas das moléculas em estudo têm de ser manualmente ajustados de modo a estarem aptos a serem utilizados no processo de docking molecular. As moléculas de água, os ligandos nativos e as cadeias suplementares da macromolécula são removidos através do programa PyMOL. No ADT é adicionado carga e resíduos flexíveis aos ficheiros do receptor e ligando, os quais são posteriormente gravados em formato pdbqt. A grelha de busca também é definida neste programa. De seguida correm-se os programas de docking molecular (AD4 e Vina) separadamente nos seus modos de docking rígido e flexível. O uso simultâneo dos dois programas e a comparação dos resultados obtidos fornecem uma forma de validação dos cálculos. Como forma adicional de validação dos cálculos, procedeu-se ao re-docking dos pares cristalográficos CYP-ligando nativo de forma a comparar os resultados com os dados obtidos experimentalmente. Uma vez que o programa Vina é mais recente que o AD4, a necessidade de ter uma comparação mais equitativa levou a que se procedesse à alteração das cargas do grupo hémicos dos CYPs a acoplar pelo AD4 por cargas hémicas mais precisas, as quais foram fornecidas pelo trabalho de Shahrokh, K. et al.; 2012. Uma revisão da literatura referente à inibição de CYPs por ITCs foi tida em conta por forma a se proceder à escolha dos CYPs a serem alvo de acoplamento molecular bem como ter uma forma de comparar os resultados obtidos in silico com os obtidos experimentalmente. Os valores experimentais de constante de inibição [Ki (μM)] de alguns ligandos foram usados como forma de validação dos resultados das simulações de docking. Enquanto o software AD4 fornece estimativas directas de Ki (sendo apenas necessária uma conversão de mM para μM), os valores de constantes de afinidade dados pelo software Vina têm de ser convertidos em valores de Ki. Ambos os programas fornecem informação relativamente à raíz quadrada do desvio médio (RMSD) dos ligandos. O RMSD corresponde ao desvio médio da estrutura do ligando após o acoplamento face à sua posição cristalográfica original. Os valores de RMSD obtidos pelo programa AD4 foram os únicos utilizados uma vez que o Vina calcula o RMSD usando como referência não a estrutura original do mesmo mas sim melhor estrutura acoplada do ligando. A análise dos resultados obtidos mostrou que as melhores estruturas acopladas por ambos os programas eram na sua grande maioria muito semelhantes às estruturas cristalográficas correspondentes. Também se constatou que a sua localização bem como orientação tridimensional eram as mais semelhantes com a estrutura cristalográfica. No entanto, o programa Vina foi capaz de gerar melhores resultados de Ki em relação aos encontrados na literatura quando comparado com os obtidos pelo AD4. Relativamente aos modos de acoplamento rígido e flexível, verificou-se que o programa Vina conseguiu gerar os melhores resultados nas duas situações. No entanto, quando a análise é feita em termos de programa, verifica-se que o Vina é melhor em acoplamento flexível enquanto que o AD4 é melhor em acoplamento rígido. Visto que existem várias estruturas cristalográficas do mesmo CYP, importa responder se o acoplamento de um ligando com o seu parceiro cristalográfico é capaz de gerar um melhor resultado do que com uma estrutura diferente mas do mesmo CYP. Em ambos os programas, alguns ligandos conseguem de facto ter um melhor valor de Ki quando acoplados com o seu parceiro cristalográfico. No entanto, maioritariamente isto só ocorre para o segundo melhor resultado. Apesar de o receptor sofrer algum ajuste ao acomodar o ligando, é possível que outros ligandos de estrutura parecida ocupar com alta afinidade o espaço tridimensional deixado vago pelo ligando original. Uma vez que existem diferentes estruturas cristalográficas do mesmo par CYP-ligando, procedeu-se ao acoplamento do mesmo tipo de ligando mas com as outras estruturas referentes ao mesmo par de modo a ver se o programa AD4 conseguia descobrir alguma diferença. Tal não foi verificado, não havendo nenhuma diferença tanto ao nível do modo de acoplamento como de valores de Ki ou RMSD. Tal acontecimento deve-se possivelmente ao facto de que o processo de cristalização ter sido refinado até ao ponto em que certas variáveis, como quem ou quando os complexos foram cristalizados ter pouca ou nenhuma importância no produto final de cristalização. De seguida procedeu-se ao acoplamento dos diversos CYPs com ligandos exógenos de forma a testar se os programas de acoplamento usados conseguiam distinguir um verdadeiro ligando de um não ligando. O que se verificou no nodo de acoplamento rígido foi que o único ligando escolhido capaz de exercer um controlo negativo sob o acoplamento nos CYPs 2A6/13 e 2B6 foi o 2QJ, facto que pode estar ligado à sua elevada complexidade estrutural. No caso do CYP2B6, como 2QJ é um ligando endógeno, o ligando IND foi aquele que acabou por funcionar como controlo negativo aceitável. De um modo geral, não houve nenhum controlo negativo que se destacasse quando de procedeu ao acoplamento flexível. Tal pode dever-se ao facto de que no modo flexível, um outrora controlo negativo tenha depois espaço de manobra no interior do centro activo de modo a conseguir produzir um valor de Ki bastante inferior ao do produzido em modo rígido. O único ligando exógeno aceitável foi o 3QO quando este era acoplado ao CYP2A13 no programa Vina. Ambos os programas de acoplamento usados são bons a acoplar ligandos que reúnam as seguintes características: moléculas não-polares, com um ou dois anéis (preferencialmente) aromáticos ou com uma estrutura em forma de cadeira e com poucas a nenhuma ligação rodável. No caso dos ITCs e para ambos os programas, estes constituem bons inibidores de CYP2A6/2A13, inibidores moderados de CYP2B6 e maus inibidores de CYP2C9. PHITC é um excelente inibidor de CYP2A13

Evaluation of a quality improvement intervention to reduce anastomotic leak following right colectomy (EAGLE): pragmatic, batched stepped-wedge, cluster-randomized trial in 64 countries

Background Anastomotic leak affects 8 per cent of patients after right colectomy with a 10-fold increased risk of postoperative death. The EAGLE study aimed to develop and test whether an international, standardized quality improvement intervention could reduce anastomotic leaks. Methods The internationally intended protocol, iteratively co-developed by a multistage Delphi process, comprised an online educational module introducing risk stratification, an intraoperative checklist, and harmonized surgical techniques. Clusters (hospital teams) were randomized to one of three arms with varied sequences of intervention/data collection by a derived stepped-wedge batch design (at least 18 hospital teams per batch). Patients were blinded to the study allocation. Low- and middle-income country enrolment was encouraged. The primary outcome (assessed by intention to treat) was anastomotic leak rate, and subgroup analyses by module completion (at least 80 per cent of surgeons, high engagement; less than 50 per cent, low engagement) were preplanned. Results A total 355 hospital teams registered, with 332 from 64 countries (39.2 per cent low and middle income) included in the final analysis. The online modules were completed by half of the surgeons (2143 of 4411). The primary analysis included 3039 of the 3268 patients recruited (206 patients had no anastomosis and 23 were lost to follow-up), with anastomotic leaks arising before and after the intervention in 10.1 and 9.6 per cent respectively (adjusted OR 0.87, 95 per cent c.i. 0.59 to 1.30; P = 0.498). The proportion of surgeons completing the educational modules was an influence: the leak rate decreased from 12.2 per cent (61 of 500) before intervention to 5.1 per cent (24 of 473) after intervention in high-engagement centres (adjusted OR 0.36, 0.20 to 0.64; P < 0.001), but this was not observed in low-engagement hospitals (8.3 per cent (59 of 714) and 13.8 per cent (61 of 443) respectively; adjusted OR 2.09, 1.31 to 3.31). Conclusion Completion of globally available digital training by engaged teams can alter anastomotic leak rates. Registration number: NCT04270721 (http://www.clinicaltrials.gov)