Folding of a cyclin box: linking multitarget binding to marginal stability, oligomerization, and aggregation of the retinoblastoma tumor suppressor AB pocket domain

The retinoblastoma tumor suppressor (Rb) controls the proliferation, differentiation, and survival of cells in most eukaryotes with a role in the fate of stem cells. Its inactivation by mutation or oncogenic viruses is required for cellular transformation and eventually carcinogenesis. The high conservation of the Rb cyclin fold prompted us to investigate the link between conformational stability and ligand binding properties of the RbAB pocket domain. RbAB unfolding presents a three-state transition involving cooperative secondary and tertiary structure changes and a partially folded intermediate that can oligomerize. The first transition corresponds to unfolding of the metastable B subdomain containing the binding site for the LXCXE motif present in cellular and viral targets, and the second transition corresponds to the stable A subdomain. The low thermodynamic stability of RbAB translates into a propensity to rapidly oligomerize and aggregate at 37 °C (T50 = 28 min) that is suppressed by human papillomavirus E7 and E2F peptide ligands, suggesting that Rb is likely stabilized in vivo through binding to target proteins. We propose that marginal stability and associated oligomerization may be conserved for function as a "hub" protein, allowing the formation of multiprotein complexes, which could constitute a robust mechanism to retain its cell cycle regulatory role throughout evolution. Decreased stability and oligomerization are shared with the p53 tumor suppressor, suggesting a link between folding and function in these two essential cell regulators that are inactivated in most cancers and operate within multitarget signaling pathways.Fil: Chemes, Lucia Beatriz. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Sánchez Miguel, Ignacio Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentin

Regulation of Tacaribe mammarenavirus translation: Positive 5' and negative 3' elements and role of key cellular factors

Mammarenaviruses are enveloped viruses with a bisegmented negativestranded RNA genome that encodes the nucleocapsid protein (NP), the envelope glycoprotein precursor (GPC), the RNA polymerase (L), and a RING matrix protein (Z). Viral proteins are synthesized from subgenomic mRNAs bearing a capped 5' untranslated region (UTR) and lacking 3' poly(A) tail. We analyzed the translation strategy of Tacaribe virus (TCRV), a prototype of the New World mammarenaviruses. A virus-like transcript that carries a reporter gene in place of the NP open reading frame and transcripts bearing modified 5' and/or 3' UTR were evaluated in a cellbased translation assay. We found that the presence of the cap structure at the 5' end dramatically increases translation efficiency and that the viral 5' UTR comprises stimulatory signals while the 3' UTR,specifically the presence of a terminal C+G-rich sequence and/or a stem-loop structure, down-modulates translation. Additionally, translation was profoundly reduced in eukaryotic initiation factor (eIF) 4G-inactivated cells, whereas depletion of intracellular levels of eIF4E had less impact on virus-like mRNA translation than on a cell-like transcript. Translation efficiency was independent of NP expression or TCRV infection. Our results indicate that TCRV mRNAs are translated using a cap-dependent mechanism, whose efficiency relies on the interplay between stimulatory signals in the 5' UTR and a negative modulatory element in the 3' UTR. The low dependence on eIF4E suggests that viral mRNAs may engage yet-unknown noncanonical host factors for a cap-dependent initiation mechanism.Fil: Foscaldi, Sabrina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: D'antuono, Alejandra Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Scolaro, Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Lopez, Nora Mabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentin

Viral intrinsically disordered proteins: structural dissection of the human papilomavirus E7 oncoprotein and the respiratory syncytial virus P phosphoprotein

Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs) son proteínas funcionales que carecen de estructura secundaria y terciaria definidas en solución. Este tipo de categoría estructural se encuentra sobrerepresentada en proteínas virales, otorgándole multifuncionalidad y versatilidad en las interacciones que establecen. Debido a flexibilidad asociada a las distintas transiciones conformacionales que presentan, las IDPs son muy difíciles de caracterizar estructuralmente, debiéndose recurrir principalmente a técnicas de estudio en solución. En este trabajo se estudiaron dos modelos de IDPs virales: el dominio amino-terminal de la oncoproteína E7 (E7N) del virus del papiloma humano (HPV-16) y la fosfoproteína P del virus sincicial respiratorio humano (RSV). En primer lugar, utilizando un abordaje de fragmentación en conjunto con medidas de dicroismo circular y resonancia magnética nuclear, se estudiaron las tendencias conformacionales del dominio E7N. Identificamos tres regiones con estructura secundaria local y transitoria: dos α- hélices dentro de las regiones conservadas CR1 y CR2, y una región que adopta hélice de poliprolinas tipo II (PII) dentro del CR2. Las dos α-hélices se encuentran pobladas en forma parcial, representando solo al 20% de la población de moléculas de E7N. Por otro lado, demostramos que la hélice-II presenta transiciones conformacionales entre PII y α-hélice moduladas por cambios de pH. Estas regiones de estructura local coinciden con los motivos lineales de interacción descriptos para este dominio, así como con sitios que experimentan modificaciones post-traduccionales. Estas características sugieren que dichas transiciones estructurales podrían modular la accesibilidad a estos motivos, regulando la interacción con sus proteínas blanco. En segundo lugar, utilizando distintas proteínas recombinantes, demostramos por primera vez la naturaleza IDP de la proteína P de RSV. La misma contiene dos módulos intrínsecamente desordenados, los cuales presentan distinto contenido de desorden. Definimos al dominio Cterminal de P como un dominio con características en solución de tipo pre-molten globule like IDP, y al dominio N-terminal como un dominio con características de tipo random-coil like IDP. Describimos que P presenta un comportamiento térmico anómalo, conteniendo en el dominio C-terminal un elemento marginalmente estable modulable por variaciones de temperatura dentro del rango de temperaturas fisiológico. En conclusión, estos ejemplos resaltan la flexibilidad funcional inherente de las IDPs, la cual les permite ser moduladas por cambios en el entorno. Esta capacidad permite a su vez explicar la plétora de procesos biológicos en los cuales se encuentran involucradas

Circular dichroism techniques for the analysis of intinsically disordered proteins and domains

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and powerful technique, whichallows for the assessment of the conformational properties of a protein or protein domain.Intrinsically disordered proteins (IDPs), as discussed throughout this series, differ fromrandom coil polypeptides in that different regions present specific conformationalpreferences, exhibiting dynamic secondary structure content (1). These dynamic secondarystructure elements can be stabilized or perturbed by different chemical (solvent, ionicstrength, pH) or physical (temperature) agents, by post-translational modifications, and byligands. This information is important for defining ID nature. As IDPs present dynamicconformations, circular dichroism measurements (and other approaches as well) should becarried out not as single spectra performed in unique conditions, but instead changing thechemical conditions and observing the behavior, as part of the determination of the ID nature.In this chapter, we present the basic methodology for performing Far-UV CDmeasurements on a protein of interest and for identifying and characterizing intrinsicallydisordered regions, and several protocols for the analysis of residual secondary structurepresent in the protein under study. These techniques are straightforward to perform; theyrequire minimal training and can be preliminary to more complex methodologies such asNMR.Fil: Chemes, Lucia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin

Intrinsic Disorder to Order Transitions in the Scaffold Phosphoprotein P from the Respiratory Syncytial Virus RNA Polymerase Complex

Intrinsic disorder is at the center of biochemical regulation and is particularly overrepresented among the often multifunctional viral proteins. Replication and transcription of the respiratory syncytial virus (RSV) relies on a RNA polymerase complex with a phosphoprotein cofactor P as the structural scaffold, which consists of a four-helix bundle tetramerization domain flanked by two domains predicted to be intrinsically disordered. Because intrinsic disorder cannot be reduced to a defined atomic structure, we tackled the experimental dissection of the disorder-order transitions of P by a domain fragmentation approach. P remains as a tetramer above 70 °C but shows a pronounced reversible secondary structure transition between 10 and 60 °C. While the N-terminal module behaves as a random coil-like IDP in a manner independent of tetramerization, the isolated C-terminal module displays a cooperative and reversible metastable transition. When linked to the tetramerization domain, the C-terminal module becomes markedly more structured and stable, with strong ANS binding. Therefore, the tertiary structure in the C-terminal module is not compact, conferring "late" molten globule-like IDP properties, stabilized by interactions favored by tetramerization. The presence of a folded structure highly sensitive to temperature, reversibly and almost instantly formed and broken, suggests a temperature sensing activity. The marginal stability allows for exposure of protein binding sites, offering a thermodynamic and kinetic fine-tuning in order-disorder transitions, essential for the assembly and function of the RSV RNA polymerase complex.Fil: Noval, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Esperante, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Molina, Ivana Gisele. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Chemes, Lucia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Universidade Federal do Rio de Janeiro; Brasi

A new inorganic photolabile protecting group for highly efficient visible light GABA uncaging

Inhibiting with visible light. An inorganic‐based caged compound of the inhibitory neurotransmitter, γ‐amino butyric acid (GABA), was prepared and photolysed by light at 450 nm with the highest uncaging quantum yield reported to date. GABA ion channels were activated by irradiation in a biological preparation by using this caged compound. (Image courtesy of the CNS Forum http://www.cnsforum.com)Fil: Zayat, Leonardo Martin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Campi, Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Calero, Cecilia Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Calvo, Daniel Juan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Etchenique, Roberto Argentino. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; Argentin

Hidden Structural Codes in Protein Intrinsic Disorder

Intrinsic disorder is a major structural category in biology, accounting for more than 30% of coding regions across the domains of life, yet consists of conformational ensembles in equilibrium, a major challenge in protein chemistry. Anciently evolved papillomavirus genomes constitute an unparalleled case for sequence to structure-function correlation in cases in which there are no folded structures. E7, the major transforming oncoprotein of human papillomaviruses, is a paradigmatic example among the intrinsically disordered proteins. Analysis of a large number of sequences of the same viral protein allowed for the identification of a handful of residues with absolute conservation, scattered along the sequence of its N-terminal intrinsically disordered domain, which intriguingly are mostly leucine residues. Mutation of these led to a pronounced increase in both α-helix and β-sheet structural content, reflected by drastic effects on equilibrium propensities and oligomerization kinetics, and uncovers the existence of local structural elements that oppose canonical folding. These folding relays suggest the existence of yet undefined hidden structural codes behind intrinsic disorder in this model protein. Thus, evolution pinpoints conformational hot spots that could have not been identified by direct experimental methods for analyzing or perturbing the equilibrium of an intrinsically disordered protein ensembleFil: Borkosky, Silvia Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Camporeale, Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Chemes, Lucia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Risso, Marikena Guadalupe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Noval, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. University of New York; Estados UnidosFil: Sánchez Miguel, Ignacio Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Alonso, Leonardo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin