Strukturbasiertes Design, Synthese und Affinitätsbestimmung neuartiger HIV-1-Protease-Inhibitoren

Mit dem humanen Immunschwäche Virus (HIV), dem Verursacher des erworbenen Immunschwäche Syndroms, welches auch als AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bezeichnet wird, sind heute weltweit 34 Millionen Menschen infiziert. Trotz beachtlicher Erfolge mit den 26 aktuell zugelassenen Wirkstoffen im Kampf gegen das Virus, stellen Resistenzen und Nebenwirkungen weiterhin eine große Herausforderung für die Arzneistoffforschung dar. Ein bedeutendes Zielenzym für Virustatika ist die HIV-Protease, ein virales Enzym, welches für die Vermehrungsfähigkeit von HIV essentiell ist. Zurzeit befinden sich 10 zugelassene HIV-Protease-Inhibitoren auf dem Markt. Um die bestehenden Probleme der Verträglichkeit und der Resistenzbildung zu lösen, sind jedoch weiterhin sowohl die akademische als auch die industrielle Forschung gefragt, ihre Anstrengungen zur Entwicklung neuer, besserer HIV-Protease-Inhibitoren fortzusetzen. Da die HIV-Protease, mit über 600 in der PDB (Protein Data Bank) hinterlegten Strukturen, eins der am besten kristallographisch untersuchten Enzyme mit medi¬zinischer Relevanz darstellt, ist das strukturbasierte Wirkstoffdesign eine vielversprechende Methode zur Entwicklung neuer HIV-Protease Inhibitoren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten in einem iterativen Prozess aus strukturbasiertem Design, Synthese und Affinitätsbestimmung neue Inhibitoren der HIV-Protease entwickelt und geeignete Vertreter für einen Zellassay identifiziert werden. Zur Bewertung der Inhibitoren sollte neben dem Ki die Ligandeneffizienz herangezogen werden, da diese eine gute Vergleichbarkeit zwischen Inhibitoren unterschiedlichen Molekulargewichts ermöglicht. Als Zielwert für eine arzneistoffartige (im Englischen druglike) Ver¬bin¬dung gilt eine Ligandeneffizienz von -0,29 kcal/mol, ein Wert der etwa einem 10 nM Inhibitor mit einem Molekulargewicht von ca. 500 g/mol entspricht. Ausgehend von dem sehr potenten aber relativ großen HIV-Protease-Inhibitor AB111 sollten in dieser Arbeit kleinere Inhibitoren der HIV-Protease mit einer verbesserten Ligandeneffizienz strukturbasiert entworfen, dargestellt und auf ihre Enzymaffinität hin untersucht werden. Der erste Ansatz bestand in der Synthese von dreiarmigen Pyrrolidin-basierten-Inhibitoren, welche mit zwei protonierbaren Stickstoffen die katalytische Diade adressieren. Die Ligandeneffizienz konnte gegenüber der Ausgangsverbindung zwar verbessert werden, allerdings ist der Ki der besten Verbindung mit 0,9 µM nur als moderat zu bewerten. Die SAR dieser Verbindungsklasse erwies sich zudem als nicht additiv und auch mit Dockingexperimenten nicht vorhersagbar. Im zweiten Ansatz wurde mit den Oxalsäureamid-Bizyklen ein effizienteres Grundgerüst ent-wickelt, welches mit einem starren Ringsystem sowohl die katalytische Diade der Protease als auch deren Flap-Region adressiert. Bereits die nur zwei Spezifitätstaschen besetzenden Oxalsäureamid-Bizyklen erwiesen sich mit einer Ligandeneffizienz der bes¬ten Verbindung von -0,27 kcal/mol als ausgesprochen vielversprechend, was vermutlich zu einem großen Teil auf einen günstigen entropischen Beitrag des rigiden bizyklischen Ringsystems zur Bindungsenergie zurückzuführen ist. In einem weiteren Optimierungszyklus wurden drei- und vierarmige bizyklische Inhibitoren synthetisiert, um zusätzliche Spezifitätstaschen der HIV-Protease zu besetzen. Drei dieser Verbindungen erreichen oder übertreffen den Zielwert für die Ligandeneffizienz, bleiben aber dennoch mit dem Molekulargewicht in einem günstigen Bereich von unter 500 g/mol. Mit einem Ki von 7 nM liegt die beste der dargestellten Verbindungen zudem in einem sehr guten Affinitätsbereich für einen potentiellen Arzneistoff. Im Zellassay zeigten die ausgewählten bizyklischen Inhibitoren allerdings keine Aktivität, weshalb hier ein Prodrug-Ansatz verfolgt wurde. Carbamatprodrugs der Pyrrolidin-basierten bizyklischen Inhibitoren sollten ungeladen die Zellmembran passieren können und im Zellinneren durch Esterasen, unter Freisetzung des basischen Pyrrolidins, gespalten werden. Die im Zellassay aktivste Verbindung dieser Arbeit stellt ein Methylcarbamat-Prodrug eines vierarmigen bizyklischen Inhibitors dar, welcher eine Zellaktivität von 42 % bei 10 µM aufweist

Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.

Endothelial cells play a critical role in the adaptation of tissues to injury. Tissue ischemia induced by infarction leads to profound changes in endothelial cell functions and can induce transition to a mesenchymal state. Here we explore the kinetics and individual cellular responses of endothelial cells after myocardial infarction by using single cell RNA sequencing. This study demonstrates a time dependent switch in endothelial cell proliferation and inflammation associated with transient changes in metabolic gene signatures. Trajectory analysis reveals that the majority of endothelial cells 3 to 7 days after myocardial infarction acquire a transient state, characterized by mesenchymal gene expression, which returns to baseline 14 days after injury. Lineage tracing, using the Cdh5-CreERT2;mT/mG mice followed by single cell RNA sequencing, confirms the transient mesenchymal transition and reveals additional hypoxic and inflammatory signatures of endothelial cells during early and late states after injury. These data suggest that endothelial cells undergo a transient mes-enchymal activation concomitant with a metabolic adaptation within the first days after myocardial infarction but do not acquire a long-term mesenchymal fate. This mesenchymal activation may facilitate endothelial cell migration and clonal expansion to regenerate the vascular network

Bi-allelic variants in CELSR3 are implicated in central nervous system and urinary tract anomalies

CELSR3 codes for a planar cell polarity protein. We describe twelve affected individuals from eleven independent families with bi-allelic variants in CELSR3. Affected individuals presented with an overlapping phenotypic spectrum comprising central nervous system (CNS) anomalies (7/12), combined CNS anomalies and congenital anomalies of the kidneys and urinary tract (CAKUT) (3/12) and CAKUT only (2/12). Computational simulation of the 3D protein structure suggests the position of the identified variants to be implicated in penetrance and phenotype expression. CELSR3 immunolocalization in human embryonic urinary tract and transient suppression and rescue experiments of Celsr3 in fluorescent zebrafish reporter lines further support an embryonic role of CELSR3 in CNS and urinary tract formation.</p

Framework and baseline examination of the German National Cohort (NAKO)

The German National Cohort (NAKO) is a multidisciplinary, population-based prospective cohort study that aims to investigate the causes of widespread diseases, identify risk factors and improve early detection and prevention of disease. Specifically, NAKO is designed to identify novel and better characterize established risk and protection factors for the development of cardiovascular diseases, cancer, diabetes, neurodegenerative and psychiatric diseases, musculoskeletal diseases, respiratory and infectious diseases in a random sample of the general population. Between 2014 and 2019, a total of 205,415 men and women aged 19–74 years were recruited and examined in 18 study centres in Germany. The baseline assessment included a face-to-face interview, self-administered questionnaires and a wide range of biomedical examinations. Biomaterials were collected from all participants including serum, EDTA plasma, buffy coats, RNA and erythrocytes, urine, saliva, nasal swabs and stool. In 56,971 participants, an intensified examination programme was implemented. Whole-body 3T magnetic resonance imaging was performed in 30,861 participants on dedicated scanners. NAKO collects follow-up information on incident diseases through a combination of active follow-up using self-report via written questionnaires at 2–3 year intervals and passive follow-up via record linkages. All study participants are invited for re-examinations at the study centres in 4–5 year intervals. Thereby, longitudinal information on changes in risk factor profiles and in vascular, cardiac, metabolic, neurocognitive, pulmonary and sensory function is collected. NAKO is a major resource for population-based epidemiology to identify new and tailored strategies for early detection, prediction, prevention and treatment of major diseases for the next 30 years. SUPPLEMENTARY INFORMATION: The online version contains supplementary material available at 10.1007/s10654-022-00890-5

Creative processes: From interventions in art to intervallic experiments through Bergson

The recent turn to creativity in geography has led to a proliferation of methodological frameworks that enable us to look at and think about the world differently. For the most part, creativity in geography gets mobilised as an artistic endeavour through empirical research with a particular person or product. One implication of this focus is that creativity gets tied to a foundational subject as the instigator of creative practice. In this paper I want to unpack creativity in geography through a particular theoretical lens, in order to explore a wider array of creative agencies. To this end I turn to Henri Bergson, and his very specific notion of creativity as a process of intuition at the interval. Crucially, Bergson offers a way of processually rethinking the corporeality and materiality of creative practice, enabling us to broaden our engagements with creativity so that they are more open to the diverse ways the material world engages us.<br/

Strukturbasiertes Design, Synthese und Affinitätsbestimmung neuartiger HIV-1-Protease-Inhibitoren

Mit dem humanen Immunschwäche Virus (HIV), dem Verursacher des erworbenen Immunschwäche Syndroms, welches auch als AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bezeichnet wird, sind heute weltweit 34 Millionen Menschen infiziert. Trotz beachtlicher Erfolge mit den 26 aktuell zugelassenen Wirkstoffen im Kampf gegen das Virus, stellen Resistenzen und Nebenwirkungen weiterhin eine große Herausforderung für die Arzneistoffforschung dar. Ein bedeutendes Zielenzym für Virustatika ist die HIV-Protease, ein virales Enzym, welches für die Vermehrungsfähigkeit von HIV essentiell ist. Zurzeit befinden sich 10 zugelassene HIV-Protease-Inhibitoren auf dem Markt. Um die bestehenden Probleme der Verträglichkeit und der Resistenzbildung zu lösen, sind jedoch weiterhin sowohl die akademische als auch die industrielle Forschung gefragt, ihre Anstrengungen zur Entwicklung neuer, besserer HIV-Protease-Inhibitoren fortzusetzen. Da die HIV-Protease, mit über 600 in der PDB (Protein Data Bank) hinterlegten Strukturen, eins der am besten kristallographisch untersuchten Enzyme mit medi¬zinischer Relevanz darstellt, ist das strukturbasierte Wirkstoffdesign eine vielversprechende Methode zur Entwicklung neuer HIV-Protease Inhibitoren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten in einem iterativen Prozess aus strukturbasiertem Design, Synthese und Affinitätsbestimmung neue Inhibitoren der HIV-Protease entwickelt und geeignete Vertreter für einen Zellassay identifiziert werden. Zur Bewertung der Inhibitoren sollte neben dem Ki die Ligandeneffizienz herangezogen werden, da diese eine gute Vergleichbarkeit zwischen Inhibitoren unterschiedlichen Molekulargewichts ermöglicht. Als Zielwert für eine arzneistoffartige (im Englischen druglike) Ver¬bin¬dung gilt eine Ligandeneffizienz von -0,29 kcal/mol, ein Wert der etwa einem 10 nM Inhibitor mit einem Molekulargewicht von ca. 500 g/mol entspricht. Ausgehend von dem sehr potenten aber relativ großen HIV-Protease-Inhibitor AB111 sollten in dieser Arbeit kleinere Inhibitoren der HIV-Protease mit einer verbesserten Ligandeneffizienz strukturbasiert entworfen, dargestellt und auf ihre Enzymaffinität hin untersucht werden. Der erste Ansatz bestand in der Synthese von dreiarmigen Pyrrolidin-basierten-Inhibitoren, welche mit zwei protonierbaren Stickstoffen die katalytische Diade adressieren. Die Ligandeneffizienz konnte gegenüber der Ausgangsverbindung zwar verbessert werden, allerdings ist der Ki der besten Verbindung mit 0,9 µM nur als moderat zu bewerten. Die SAR dieser Verbindungsklasse erwies sich zudem als nicht additiv und auch mit Dockingexperimenten nicht vorhersagbar. Im zweiten Ansatz wurde mit den Oxalsäureamid-Bizyklen ein effizienteres Grundgerüst ent-wickelt, welches mit einem starren Ringsystem sowohl die katalytische Diade der Protease als auch deren Flap-Region adressiert. Bereits die nur zwei Spezifitätstaschen besetzenden Oxalsäureamid-Bizyklen erwiesen sich mit einer Ligandeneffizienz der bes¬ten Verbindung von -0,27 kcal/mol als ausgesprochen vielversprechend, was vermutlich zu einem großen Teil auf einen günstigen entropischen Beitrag des rigiden bizyklischen Ringsystems zur Bindungsenergie zurückzuführen ist. In einem weiteren Optimierungszyklus wurden drei- und vierarmige bizyklische Inhibitoren synthetisiert, um zusätzliche Spezifitätstaschen der HIV-Protease zu besetzen. Drei dieser Verbindungen erreichen oder übertreffen den Zielwert für die Ligandeneffizienz, bleiben aber dennoch mit dem Molekulargewicht in einem günstigen Bereich von unter 500 g/mol. Mit einem Ki von 7 nM liegt die beste der dargestellten Verbindungen zudem in einem sehr guten Affinitätsbereich für einen potentiellen Arzneistoff. Im Zellassay zeigten die ausgewählten bizyklischen Inhibitoren allerdings keine Aktivität, weshalb hier ein Prodrug-Ansatz verfolgt wurde. Carbamatprodrugs der Pyrrolidin-basierten bizyklischen Inhibitoren sollten ungeladen die Zellmembran passieren können und im Zellinneren durch Esterasen, unter Freisetzung des basischen Pyrrolidins, gespalten werden. Die im Zellassay aktivste Verbindung dieser Arbeit stellt ein Methylcarbamat-Prodrug eines vierarmigen bizyklischen Inhibitors dar, welcher eine Zellaktivität von 42 % bei 10 µM aufweist

Identification of inhibitors of the transmembrane protease FlaK of Methanococcus maripaludis

GxGD-type intramembrane cleaving proteases (I-CLiPs) form a family of proteolytic enzymes that feature an aspartate-based catalytic mechanism. Yet, they structurally and functionally largely differ from the classical pepsin-like aspartic proteases. Among them are the archaeal enzyme FlaK, processing its substrate FlaB2 during the formation of flagella and γ-secretase, which is centrally involved in the etiology of the neurodegenerative Alzheimer's disease. We developed an optimized activity assay for FlaK and based on screening of a small in-house library and chemical synthesis, we identified compound 9 as the first inhibitor of this enzyme. Our results show that this intramembrane protease differs from classical pepsin-like aspartic proteases and give insights into the substrate recognition of this enzyme. By providing the needed tools to further study the enzymatic cycle of FlaK, our results also enable further studies towards a functional understanding of other GxGD-type I-CLiPs