Untersuchungen zur Interaktion von Staphylococcus aureus mit Thrombozyten und Endothelzellen

Staphylococcus aureus ist ein wichtiger Krankheitserreger bei intravaskulären Infektionen wie der infektiösen Endokarditis. In der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Anbindung an das Wirtsgewebe der erste wichtige Schritt. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Aufklärung des Adhäsionsmechanismus von Staphylococcus aureus an Thrombozyten und Endothelzellen durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei sowohl auf die Identifizierung der für die Interaktion relevanten Rezeptoren auf der bakteriellen Seite, als auch auf die Untersuchung von Plasmaproteinen als Brückenmoleküle gelegt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier plasmatischen Adhäsionsproteine Fibrinogen, TSP-1, vWF und Fibronektin in der flüssigen Phase konzentrationsabhängig an S. aureus binden und dass diese Bindung auch nahezu oder vollständig eine Sättigung erreicht. Die Adhäsionsproteine können dabei miteinander konkurrieren. Die Untersuchungen zur Bindung von S. aureus an Plättchen zeigten, dass nicht Fibrinogen, sondern Fibrin der Vermittler der S. aureus-Thrombozyten-Assoziation ist. Auch TSP-1 und Fibronektin haben einen Assoziat-fördernden Einfluss. Die Bakterien banden dabei vornehmlich an aktivierte Plättchen. Es konnte ein hypothetisches Modell entwickelt werden, in dem Fibrin, TSP-1 und Fibronektin auf der Oberfläche der aktivierten Plättchen große Bindungs-Cluster bilden, die eine starke Bindung von S. aureus an Thrombozyten ermöglichen. Auch für die durch S. aureus ausgelöste Plättchenaggregation ist die Bildung von löslichem Fibrin ein Schlüsselmechanismus. Die Assoziat-vermittelnde Rolle von Fibrin und die Notwendigkeit der Plättchenaktivierung ist nicht nur auf S. aureus beschränkt, sondern konnte auch für die Assoziation von unbekapselten oder leicht bekapselten Streptococcus pneumoniae-Stämmen mit Thrombozyten gezeigt werden Nachdem die Bedeutung der Plasmaproteine als Brückenmoleküle herausgestellt wurde, galt in dieser Arbeit den Adhäsinen auf S. aureus, die Plasmaproteine binden können, ein großes Interesse. Für die Interaktion von S. aureus mit dem Wirtsgewebe ist bekannt, dass der MSCRAMM-Familie der Staphylokokken-Oberflächen-Proteine eine wichtige Bedeutung zukommt. Es sind Proteine mit einem homologen Aufbau, die adhäsive Matrixmoleküle wie Kollagen, Fibrinogen oder TSP-1 binden. Die wichtigsten MSCRAMMs sind Protein A, ClfA, ClfB, FnBPA und FnBPB. Bindungsversuche mit löslichen Adhäsionsproteinen (Fibrinogen, TSP-1, vWF und Fibronektin) an S. aureus MSCRAMM-Deletionsmutanten bzw. an fnbA und fnbB expremierende Staphylococcus carnosus Stämme zeigten, dass die untersuchten MSCRAMMs promiskuitiv sind: ein MSCRAMM konnte mehrere Adhäsionsproteine binden und ein Adhäsionsprotein an mehrere MSCRAMMs. In der Eigenschaft der Promiskuität sind die MSCRAMMs den Integrinen der Eukaryonten ähnlich. Mit Hilfe von ClfA-Deletionsmutanten und fnbA und fnbB exprimierenden S. carnosus Stämmen konnte auch gezeigt werden, dass ClfA, FnBPA und FnBPB in die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation involviert sind. In der Plasmamembran von Plättchen kommen Syndecane vor. Dies sind Transmembranproteine, deren Heparansulfat-Ketten Interaktionen mit verschiedenen extrazellulären Matrixproteinen, so auch TSP-1, ermöglichen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte mit Hilfe von Syndecan-1- und Syndecan-4-knock-out Mäusen gezeigt werden, dass Syndecane die S. aureus-Plättchen-Assoziation vermitteln. S. aureus kann nicht nur an Plättchen anbinden, sondern diese auch aktivieren. Es wurde in dieser Arbeit der Vermutung nachgegangen, dass Staphylokinase mit Staphylokinase-Antikörpern einen Komplex bildet, der an den FcRIIa-Rezeptor bindet und dadurch die Plättchen aktiviert. Es konnte dazu gezeigt werden, dass sich Kaninchenplättchen nach Immunisierung mit Staphylokinase durch S. aureus besser aktivieren ließen als vor der Antikörperbildung. Als letzter Teil der Arbeit wurde die S. aureus-Endothelinteraktion untersucht. S. aureus kann besser in endovaskuläres Gewebe einwandern als andere Bakterienarten. Um einen Einblick in den Mechanismus der S. aureus-Endothelinteraktion zu erlangen, wurde der Einfluss von Fibrinogen, Fibrin, TSP-1 und Plättchen auf die Anbindung von S. aureus an und die Invasion in Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TSP-1 die Adhärenz von S. aureus an Endothelzellen steigert, ebenso steigern Plättchen zusammen mit Fibrinogen oder Fibrin die Adhärenz. Plättchen zusammen mit Fibrin steigerten auch die Invasion von S. aureus in Endothelzellen.Staphylococcus aureus is a highly virulent pathogen and a frequent cause of endovascular infections, such as infective endocarditis. Microbial adhesion to host tissue is the initial critical event in the establishment of bacterial infections. In this dissertation the mechanisms underlying the adhesion of S. aureus to platelets and to endothelial cells were examined. Special attention was focused on the identification of receptors on S. aureus that are important for the interaction and on the examination of plasma proteins acting as bridging molecules. It was shown in this study that the four adhesion proteins fibrinogen, TSP-1, vWF and fibronectin bound to S. aureus in solution in a concentration dependent manner and that this binding was almost or completely saturable. The adhesion proteins can compete against each other for the binding. Studies to examine the binding of S. aureus to platelets showed that not fibrinogen, but soluble fibrin is the main mediator of platelet-S. aureus-association. TSP-1 and fibronectin enhanced the associate formation as well. Bacteria primarily bound to activated platelets. A hypothetical model was developed in which fibrin, TSP-1 and fibronectin form large binding clusters at the surface of activated platelets to promote strong adhesion of S. aureus. Formation of soluble fibrin is the key mechanism for platelet aggregation induced by S. aureus as well. The associate-mediating function of fibrin and the necessity of platelet activation is not limited to S. aureus, but was also shown for Streptococcus pneumoniae-platelet-association. Having exposed the importance of plasma proteins as bridging molecules, the interest was directed towards the plasma protein binding adhesins of S. aureus. In the interaction of S. aureus with host tissue, it is known that the MSCRAMM-family of staphylococcal surface proteins is of major importance. These proteins have a homologous structure and bind adhesive matrix molecules like collagen, fibrinogen or TSP-1. The major MSCRAMMs are protein A, ClfA, ClfB, FnBPA and FnBPB. Using S. aureus MSCRAMM mutants and complemented mutants as well as S. carnosus that heterologously expressed fnbA or fnbB, it was shown that the studied MSCRAMMs are promiscuous. All of them bound fibrinogen, TSP-1, vWF and fibronectin. In this respect, the major MSCRAMMs resemble integrins of eucaryotic cells, as one integrin can bind several different ligands and one particular ligand may be recognized by several integrins. By using ClfA deficient S. aureus mutants and S. carnosus strains expressing fnbA or fnbB it was also shown that ClfA, FnBPA and FnBPB are involved in S. aureus-platelet-association. Syndecans are found in the plasma membrane of platelets. They are transmembrane proteins and their heparan sulfate chains allow for interaction with different extracellular matrix proteins, among them TSP-1. Using syndecan-1 and syndecan-4 knock out mice, it was shown that syndecans mediate binding of S. aureus to platelets. S. aureus is not only able to bind to platelets, but is also able to activate them. In this study it was checked on the assumption that staphylokinase forms a complex with stapylokinase-antibodies which bind to the FcRIIa-receptor and thereby activates the platelets. It was shown that rabbit platelets became activated by S. aureus easier after immunization than before antibody generation. In the last part of this thesis the S. aureus-endothelial cell-interaction was studied. S. aureus is known to colonise and invade endovascular tissue better than other bacterial species. To get an insight into the mechanisms underlying the processes of S. aureus-endothelial cell interaction, the influence of fibrinogen, fibrin, TSP-1 and platelets on the interaction was studied. It was shown that TSP-1 as well as platelets combined with fibrinogen or fibrin enhances the adherence of S. aureus to endothelial cells. Moreover, platelets in combination with fibrin enhanced the invasion of endothelial cells

Familienbesteuerung in Österreich und Deutschland: Eine vergleichende Analyse unter Berücksichtigung aktueller Steuerreformen

This paper compares the taxation of families with children in Austria and Germany with respect to the income situation of three representative example families. The first section deals with the legal background of family taxation an provides an analysis of the distributional effects of the Austrian family package, which is part of the income tax reform 2009. The results show that absolute savings due to the Austrian tax reform 2009 are higher, the more children and/or sources of income a family has. We show that the level of relative savings is the highest for single-parent families with a family income of 40.000 Euro and reaches nearly 15 percent of the family net income. We compare the taxation of Austrian and German families by measuring absolute savings due to the family packages as well as by calculating effective average tax rates for the example families. We show that the advantageousness of one country is primarily driven by the deductible amount of cost for childcare as well as the inclusion of Austrian supplemental wages (vacation and Christmas bonus). Not including the Austrian supplemental wages leaves German families better off, with the maximum advantage for German families accounting for about 6 percent. Including the Austrian beneficial taxation of supplemental wages instead favours Austrian families with the maximum advantage being about 8 percent. The results show that the Austrian system of separate taxation does not necessarily result in lower after tax incomes than the German system of joint assessment. In some cases it leaves Austrian families even better off. An adequate tax relief for families does not necessarily require elements of joint taxation; other tax measures can yield the same effect without accepting the disadvantages of joint assessment. -- In diesem Beitrag wird erstmals ein Vergleich der Besteuerung von Familien mit Kindern in Österreich und Deutschland anhand von drei repräsentativen Musterfamilien in unterschiedlichen Einkommenssituationen durchgeführt. Dabei wird in einem ersten Schritt die österreichische Besteuerung von Familien rechtlich dargestellt und das als Teil der österreichischen Steuerreform 2009 beschlossene Familienpaket einer verteilungspolitischen Analyse unterzogen. Die absolute Steuerersparnis aus der österreichischen Steuerreform 2009 ist umso höher, je mehr Kinder und je mehr Einkommensbezieher eine Familie besitzt. Relativ betrachtet ergibt sich bis zu einer Familieneinkommensgrenze von 40.000 Euro für Alleinerzieher die höchste Ersparnis, die in bestimmten Einkommensbereichen über 15% des Nettofamilieneinkommens beträgt. Der Vergleich mit der deutschen Besteuerung von Familien anhand der absoluten Entlastung und effektiven Durchschnittsteuersätze für die einzelnen Musterfamilien zeigt, dass die Vorteilhaftigkeit vor allem von der Höhe der abzugsfähigen Kinderbetreuungskosten und der Berücksichtigung sonstiger Bezüge in Österreich bestimmt wird. Ohne Berücksichtigung von sonstigen Bezügen beträgt der maximale Vorteil der deutschen Besteuerung rund 6%, unter Berücksichtigung der sonstigen Bezüge hingegen kann in Österreich ein steuerlicher Vorteil von bis zu 8% erzielt werden. Im Ergebnis zeigt sich, dass vor allem aufgrund der steuerlichen Begünstigung der sonstigen Bezüge in Österreich auch ohne Einführung eines Familiensplitting der österreichische Weg der Familienbesteuerung zu keinen nennenswerten Nachteilen oder sogar zu Vorteilen für österreichische Familien im Vergleich zu deutschen Familien führt. Die Besteuerung von Familien muss daher nicht zwingend Splitting-Elemente enthalten, um eine Entlastung zu gewährleisten vielmehr kann durch andere steuerliche Maßnahmen derselbe Entlastungseffekt erzielt werden, ohne dabei die bekannten Nachteile des Splittings in Kauf nehmen zu müssen.

The endoplasmic reticulum membrane protein complex localizes to the mitochondrial - endoplasmic reticulum interface and its subunits modulate phospholipid biosynthesis in Trypanosoma brucei.

The endoplasmic reticulum membrane complex (EMC) is a versatile complex that plays a key role in membrane protein biogenesis in the ER. Deletion of the complex has wide-ranging consequences including ER stress, disturbance in lipid transport and organelle tethering, among others. Here we report the function and organization of the evolutionarily conserved EMC (TbEMC) in the highly diverged eukaryote, Trypanosoma brucei. Using (co-) immunoprecipitation experiments in combination with mass spectrometry and whole cell proteomic analyses of parasites after depletion of select TbEMC subunits, we demonstrate that the TbEMC is composed of 9 subunits that are present in a high molecular mass complex localizing to the mitochondrial-endoplasmic reticulum interface. Knocking out or knocking down of single TbEMC subunits led to growth defects of T. brucei procyclic forms in culture. Interestingly, we found that depletion of individual TbEMC subunits lead to disruption of de novo synthesis of phosphatidylcholine (PC) or phosphatidylethanolamine (PE), the two most abundant phospholipid classes in T. brucei. Downregulation of TbEMC1 or TbEMC3 inhibited formation of PC while depletion of TbEMC8 inhibited PE synthesis, pointing to a role of the TbEMC in phospholipid synthesis. In addition, we found that in TbEMC7 knock-out parasites, TbEMC3 is released from the complex, implying that TbEMC7 is essential for the formation or the maintenance of the TbEMC

Isolating Crucial Steps in Induction of Infective Endocarditis With Preclinical Modeling of Host Pathogen Interaction

Animal models of Staphylococcus aureus infective endocarditis (IE), especially in rodents, are commonly used to investigate the underlying pathogenesis, disease progression, potential diagnostic approaches, and therapeutic treatment. All these models are based on surgical interventions, and imply valve trauma by placing a polyurethane catheter at the aortic root. While the influence of endothelial damage and inflammation on the induction of IE has been studied intensively, the role of the catheter, as permanent source of bacteremia, and the interplay with bacterial virulence factors during the formation of IE is poorly understood. In our study, we aimed at identifying which set of preconditions is required for induction and formation of IE: (1) tissue injury, (2) permanent presence of bacteria, and (3) presence of the full bacterial repertoire of adhesion proteins. We investigated the manifestation of the disease in different modifications of the animal model, considering different degrees of endothelial damage and the presence or absence of the catheter. In four infection models the induction of IE was assessed by using two bacterial strains with different expression patterns of virulence factors – S. aureus 6850 and Newman. In vivo magnetic resonance imaging showed conspicuous morphological structures on the aortic valves, when an endothelial damage and a continuous bacterial source were present simultaneously. Cellular and inflammatory pathophysiology were characterized additionally by histology, real-time quantitative polymerase chain reaction analysis, and bacterial counts, revealing strain-specific pathogenesis and manifestation of IE, crucially influenced by bacterial adherence and toxicity. The severity of IE was dependent on the degree of endothelial irritation. However, even severe endothelial damage in the absence of a permanent bacterial source resulted in reduced valve infection. The spread of bacteria to other organs was also dependent on the pathogenic profile of the infectious agent

A Msp1-containing complex removes orphaned proteins in the mitochondrial outer membrane of <i>T. brucei</i>

The AAA-ATPase Msp1 extracts mislocalised outer membrane proteins and thus contributes to mitochondrial proteostasis. Using pulldown experiments, we show that trypanosomal Msp1 localises to both glycosomes and the mitochondrial outer membrane, where it forms a complex with four outer membrane proteins. The trypanosome-specific pATOM36 mediates complex assembly of α-helically anchored mitochondrial outer membrane proteins such as protein translocase subunits. Inhibition of their assembly triggers a pathway that results in the proteasomal digestion of unassembled substrates. Using inducible single, double, and triple RNAi cell lines combined with proteomic analyses, we demonstrate that not only Msp1 but also the trypanosomal homolog of the AAA-ATPase VCP are implicated in this quality control pathway. Moreover, in the absence of VCP three out of the four Msp1-interacting mitochondrial proteins are required for efficient proteasomal digestion of pATOM36 substrates, suggesting they act in concert with Msp1. pATOM36 is a functional analog of the yeast mitochondrial import complex complex and possibly of human mitochondrial animal-specific carrier homolog 2, suggesting that similar mitochondrial quality control pathways linked to Msp1 might also exist in yeast and humans

Drug-resistance mechanisms and tuberculosis drugs.

This publication presents independent research supported by the Health Innovation Challenge Fund (HICF-T5-342 and WT098600), a parallel funding partnership between the UK Department of Health and Wellcome Trust.This is the final version of the article. It first appeared at http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(14)62450-8

Evaluation of whole- genome sequence data analysis approaches for short- and long- read sequencing of Mycobacterium tuberculosis

Whole-genome sequencing (WGS) of Mycobacterium tuberculosis (MTB) isolates can be used to get an accurate diagnosis, to guide clinical decision making, to control tuberculosis (TB) and for outbreak investigations. We evaluated the performance of long-read (LR) and/or short-read (SR) sequencing for anti-TB drug-resistance prediction using the TBProfiler and Mykrobe tools, the fraction of genome recovery, assembly accuracies and the robustness of two typing approaches based on core-genome SNP (cgSNP) typing and core-genome multi-locus sequence typing (cgMLST). Most of the discrepancies between phenotypic drug-susceptibility testing (DST) and drug-resistance prediction were observed for the first-line drugs rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol, mainly with LR sequence data. Resistance prediction to second-line drugs made by both TBProfiler and Mykrobe tools with SR- and LR-sequence data were in complete agreement with phenotypic DST except for one isolate. The SR assemblies were more accurate than the LR assemblies, having significantly (P<0.05) fewer indels and mismatches per 100 kbp. However, the hybrid and LR assemblies had slightly higher genome fractions. For LR assemblies, Canu followed by Racon, and Medaka polishing was the most accurate approach. The cgSNP approach, based on either reads or assemblies, was more robust than the cgMLST approach, especially for LR sequence data. In conclusion, anti-TB drug-resistance prediction, particularly with only LR sequence data, remains challenging, especially for first-line drugs. In addition, SR assemblies appear more accurate than LR ones, and reproducible phylogeny can be achieved using cgSNP approaches