Identificação de bactérias contaminantes de fermento de cachaça por seqüenciamento do gene 16s rDNA

Cachaça is a typical Brazilian liquor produced from the distillation of fermented sugarcane juice mainly by Saccharomyces cerevisiae. Most of the domestic production is artisanal, and producers usually are not concerned regarding microbiological control of the fermentation. This study aimed to characterize the contaminant bacterial community of the yeast used in the production of cachaça in an artisanal still. Four samples were collected, of which one (NA) was used for comparison purposes and was collected one year earlier. The remaining samples were collected at three different periods: at the end of the first day of fermentation (NP), after fifteen days (NS), and thirty days after the same yeast was used (NT). Five hundred and eighty-seven sequences were analyzed from the partial sequencing of the 16S rDNA gene. Sequence analyses revealed the presence of 170 operational taxonomic units (OTUs). Of these, only one was shared among three samples and seventeen were shared between two samples. The remaining 152 OTUs were identified only once in distinct samples indicating that the contaminant bacterial population is highly dynamic along the fermentation process. Statistical analyses revealed differences in bacterial composition among samples. Undescribed species in the literature on yeasts of cachaça were found, such as Weissella cibaria, Leuconostoc citreum, and some species of Lactobacillus, in addition to some unknown bacteria. The community of bacteria in the fermentation process is much more complex than it was previously considered. No previous report is known regarding the use of this technique to determine bacterial contaminants in yeast for the production of cachaça.A cachaça é uma bebida típica brasileira produzida a partir da destilação do caldo de cana-de-açúcar fermentado principalmente por Saccharomyces cerevisiae. Grande parte da produção nacional é artesanal, e não há uma preocupação por parte dos produtores quanto ao controle microbiológico da fermentação. Este trabalho objetivou caracterizar a comunidade bacteriana contaminante do fermento utilizado na produção de cachaça em um alambique artesanal. Foram coletadas quatro amostras, sendo uma (NA) utilizada como efeito comparativo e coletada um ano anterior às demais. As restantes foram coletadas em três diferentes períodos: ao final do primeiro dia de fermentação (NP), após quinze dias (NS) e trinta dias após a utilização do mesmo fermento (NT). Foram analisadas, a partir do seqüenciamento parcial do gene 16S rDNA, 587 seqüências. As análises das seqüências revelaram a presença de 170 unidades taxonômicas operacionais. Destas, 152 foram identificadas uma única vez em diferentes amostras, dezessete foram comuns em pelo menos duas amostras e somente uma foi identificada em três amostras, evidenciando uma grande dinâmica populacional bacteriana durante o processo fermentativo. Análises estatísticas revelaram diferenças na composição bacteriana entre as amostras. Foram encontradas espécies ainda não descritas na literatura em fermentos para a produção de cachaça, como Weissella cibaria, Leuconostoc citreum e algumas espécies de Lactobacillus, além de bactérias não conhecidas. Os resultados revelaram que a comunidade de bactérias contaminantes do processo fermentativo é muito mais complexa do que se conhecida. Não há conhecimento de relato anterior sobre a utilização desta técnica para determinar contaminantes bacterianos em fermentos de cana-de-açúcar para produção de cachaça

Identification of bacterial contaminants of the cachaça ferment by sequencing of the 16S rDNA

A cachaça é uma bebida típica brasileira produzida a partir da destilação do caldo de canade- açúcar fermentado principalmente por Saccharomyces cerevisiae. Grande parte da produção nacional é artesanal, e não há uma preocupação por parte dos produtores quanto ao controle microbiológico da fermentação. Este trabalho objetivou caracterizar a comunidade bacteriana contaminante do fermento utilizado na produção de cachaça. Foram coletadas quatro amostras em um alambique artesanal. A primeira (NA) foi coletada um ano anterior às outras três e utilizada como controle. As restantes foram coletadas ao final do primeiro dia de fermentação (NP), após quinze (NS) e trinta dias (NT) utilizando o mesmo fermento. Um total de 587 seqüências de 16S rDNA foram analisadas, sendo 81 da amostra NA, 177 da amostra NP, 159 da amostra NS e 170 da amostra NT. As análises das seqüências revelaram a presença de 17 gêneros e 27 espécies, além de 27 bactérias não conhecidas. Cento e setenta unidades taxonômicas operacionais (UTOs) foram identificadas utilizando o software DOTUR com uma distância evolucionária de 0.03. Quarenta e três UTOs foram identificadas na amostra controle (NA), 38 na NP, 57 na amostra NS e 38 na terceira amostra (NT). Das 170 UTOs identificadas, apenas dezessete foram identificadas duas vezes em diferentes amostras e somente uma, identificada como Lactobacillus hilgardii, foi identificada três vezes, evidenciando uma grande dinâmica populacional bacteriana durante o processo fermentativo. Análises estatísticas utilizando o software S-LIBSHUFF indicaram diferenças significativas na composição bacteriana entre amostras. Foram encontradas espécies/gêneros ainda não descritas na literatura em fermentos de cachaça, como Weissella cibaria, Leuconostoc citreum e algumas espécies de Lactobacillus. Além destas, várias bactérias não conhecidas também foram identificadas. Os resultados revelaram que a comunidade de bactérias contaminantes do processo fermentativo é muito mais complexa do que se conhecia, com características heterofermentativas e produção de congêneres que provavelmente refletem na qualidade da bebida. Este é o primeiro relato da utilização do método de seqüenciamento do gene 16S rDNA para determinar contaminantes bacterianos em fermentados de cana-de-açúcar para produção de cachaça.Cachaça is a typical Brazilian spirit made from sugar cane fermented mainly by Saccharomyces cerevisiae. The production is mostly artisanal, and there is no microbiological control during the fermentation process. The objective of this study was to assess the bacterial community associated with the ferment used in the production of cachaça. Four ferment samples were collected from an artisanal still. The first one (NA), was collected one year previously to the other three and constituted a control reference. The remaining three samples were collected at the end of the first day of fermentation (NP), and fifteen (NS) and thirty days (NT) after using this same ferment. A total of 587 16S rDNA sequences were analyzed, being 81 sequences from the NA sample, 177 from NP, 159 from NS, and 170 from the NT sample. Sequence analyses revealed the presence of 17 genus and 27 species plus 27 unknown species. One hundred and seventy operational taxonomic units (OTUs) were identified using the DOTUR software using a cut-off evolutionary distance of 0.03. Forty three were identified in the control (NA) sample, 38 in the NP, 57 in NS, and 38 in the third (NT) sample. Of the 170 OTUs, only seventeen were detected twice in different samples and only one, identified as Lactobacillus hilgardii, was identified thrice, indicating a dynamic nature of the bacterial community during the fermentation process. Statistical analysis using the software S-LIBSHUFF indicated significant differences in the bacterial composition among samples. Our analyses also allowed to identify several bacteria not yet described as contaminants of the cachaça ferment, such as Weissella cibaria, Leuconostoc citreum and some Lactobacillus species. In addition, several unknown bacteria were also detected. The results revealed a much larger bacterial contaminant community present in the fermentative process of cachaça than previously reported with heterofermentative ability to produce secondary compounds which probably influence the quality of the final beverage. This is the first report on the utilization of the 16S rDNA sequencing method to assess the bacterial diversity of sugar cane fermentation for the production of cachaça

Physiology of the alcoholic fermentation : gene expression analysis of a Saccharomyces cerevisiae industrial strain during the fermentation process

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas ArguesoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A fermentação alcoólica realizada por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae é atualmente o principal processo em escala econômica para a produção de etanol a partir de fontes renováveis (bioetanol). Entretanto, as linhagens isoladas há quase duas décadas vêm perdendo gradualmente seu desempenho fermentativo ao longo dos anos, reduzindo o rendimento e a estabilidade do processo. Um dos fatores que contribuem para tais perdas está associado às significativas alterações operacionais do processo nestas duas décadas. Aliado a isto, pouco se conhece sobre as bases genéticas das principais linhagens comerciais utilizadas no Brasil, inviabilizando o sucesso de programas de melhoramento genético. Neste ponto, este trabalho propõe de forma inédita um estudo completo de caracterização, análise de expressão e manipulação gênica de PE-2, uma das principais linhagens usadas no processo Brasileiro. Para isto, dados da estrutura, composição e regulação do genoma foram gerados. A partir dessas informações foi desenvolvida, através de manipulações genéticas, uma linhagem auxotrófica para uracila (plataforma biológica) e outras com características de fermentação superiores ao isolado selvagem. O conceito de que o sucesso de manipulações pontuais depende de um conhecimento prévio detalhado da linhagem de interesse, compreendendo tanto suas bases genéticas quanto fisiológicas, foi validado neste estudo. Os dados aqui apresentados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de uma segunda geração de linhagens de S. cerevisiae ainda mais robustas, voltadas não apenas para a produção de bioetanol, como também para utilização em outros processos biotecnológicosAbstract: The alcoholic fermentation performed by yeasts of the specie Saccharomyces cerevisiae is the main current process to produce ethanol from renewable resources (bioethanol) under economic scale. However, strains isolated two decades ago have been gradually losing their original fermentative fitness during the years, decreasing the process yield and stability. One of the factors that contribute for these losses is associated with the meaningful process operational changes along these years. In addition to that, there is a knowledge gap regarding the genetic bases of the commercial strains used on Brazil, not leading to success of the genetic improvements programs. Hereupon, this work propose in a first time way a complete characterization, expression analysis and genetic manipulation study of PE-2, one of the most important strain used on Brazilian process. To this, structure, composition and regulation data of the genome were produced. From such information, it was developed by genetic manipulations assays an auxotrophic yeast for uracile (biological plataform) and others strains with superior fermentative characteristics in comparison with the wild isolated. The concept that the success of precise manipulations depends on the previous detailed knowledge of the interest strain, regarding the genetic and physiology bases, was confirmed herein. The data presented here also establish new perspectives for the construction of a second generation strains even more robusts, designed not only for the bioethanol production, but also to be applied on different biotechnological processesDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutor em Genetica e Biologia Molecula

Iniciadores Oligonucleotideos De Dna, MÉtodo De IdentificaÇÃo De Marcadores Moleculares De Linhagens De Saccharomyces Cerevisae E Kit De AmplificaÇÃo E IdentificaÇÃo De RegiÕes PolimÓrficas Em Genes

INICIADORES OLIGONUCLEOTIDEOS DE DNA, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DE LINHAGENS DE SACCHAROMYCES CERE VISAE E KIT DE AMPLIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE REGIÕES POLIMÓRFICAS EM GENES. A presente invenção refere-se aos iniciadores ai igo nucleotideos de DNA sense e antisense, método de identificação e diferenciação e kit para amplificação e identificação de regiões polimórficas inseridas em genes de Saccharomyces cerevisae e suas regiões flanqueadoras visando o acompanhamento da comunidade de leveduras ao longo de processos fermentativos.BRPI1015987 (A2)C07H21/04C12Q1/68C12R1/865BR2010PI15987C07H21/04C12Q1/68C12R1/86