Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas

Características do sêmen a fresco e descongelado de garanhões da raça Nordestina

RESUMO: Este estudo descreveu as características seminais, da membrana plasmática e do acrossoma de espermatozoide congelado/descongelado de 19 ejaculados de garanhões da raça Nordestina. Os aspectos analisados incluíram os parâmetros físicos do sêmen fresco; a motilidade e a longevidade do sêmen diluído e descongelado; a morfologia espermática, integridade funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide e a habilidade de ligação do espermatozoide à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha do sêmen descongelado. As variáveis foram avaliadas pela ANOVA com post hoc teste de Student Newman-Keuls (P<0,05). A MT e a MP foram maiores (P<0,05) no sêmen diluído do que no descongelado. A percentagem média de defeitos maiores, menores e totais foi muito inferior ao limite recomendado pelo CBRA. A porcentagem de reativos ao HOST foi de 14,21±1,12% e a porcentagem média de membranas íntegras detectadas pelo teste supravital de 62,22±9,06% e pela sonda SYBR-14 de 81,47±26,90. O número médio de espermatozoides ligados à MPV após a descongelação do sêmen foi de 230,39±57,09. A MT e MP no tempo 0 min do TTR foi superior (P<0,05) em relação a 150 min, não diferindo nos tempos 10 min e 30 min. Os resultados demonstram que a utilização dos testes laboratoriais adicionais ajudam no processo de avaliação das amostras, possibilitando a obtenção de informações mais confiáveis e precisas. Embora a criopreservação tenha provocado queda na motilidade seminal, o uso de diluidor contendo amidas minimizou os danos osmóticos nas células espermáticas e manteve a integridade morfológica, funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide. Estes resultados são um referencial em estudos futuros uma vez que, inexistem dados comparativos nesta raça

Evaluation of llama sperm dna using toluidine blue

Toluidine blue stain (TB) binds to DNA, allowing differentiation of spermatozoa according to the degree of chromatin condensation. The objectives of this study were to adapt a technique for evaluating sperm chromatin in llamas, determine chromatin condensation patterns in llamas using TB and determine if it is possible to use dithiothreitol (DTT) as a positive control for the stain. Two fixation times with ethanol 96° (2 and 30 minutes) and 3 incubation times with 1% DTT (30 s, 1.5 min and 3 min) were studied. Staining patterns observed were: light blue (negative, without alteration in the normal chromatin condensation), light violet (intermediate, some degree of decondensation), dark violet (positive, high degree of decondensation). No significant differences were observed between fixation times, either in samples with or without DTT. To conclude, it was possible to simplify the TB stain and determine the different patterns in llama spermatozoa. It was proved that incubation with DTT can be used as a positive control for the stain and to evaluate individual susceptibility to decondensation in vitro.Fil: Carretero, M.I. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Área de Teriogenología. Buenos Aires, ArgentinaFil: Giuliano, S.M. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Área de Teriogenología. Buenos Aires, ArgentinaFil: Giuliano, S.M. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Área de Física Biológica. Buenos Aires, ArgentinaFil: Casaretto, C.I. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Área de Teriogenología. Buenos Aires, ArgentinaFil: Gambarotta, M.C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Área de Estadística. Buenos Aires, ArgentinaFil: Neild, D.M. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Área de Teriogenología. Buenos Aires, ArgentinaEl colorante azul de toluidina (AT) se une al ADN permitiendo diferenciar espermatozoides de acuerdo al grado de condensación de la cromatina. Los objetivos de este trabajo fueron: poner a punto una técnica que evalúe la condensación de la cromatina espermática de llama, determinar los patrones de condensación para la especie mediante la tinción con AT y determinar si es posible utilizar ditíotreitol (DTT) como control positivo de la tinción. Se ensayaron 2 tiempos de fijación de las muestras con etanol 96 º (2 y 30 minutos) y 3 tiempos de incubación con DTT al 1% (30 seg, 1,5 min y 3 min). Los patrones de coloración observados fueron: coloración celeste (negativos, sin alteración en la condensación normal de la cromatina), violeta claro (intermedios, algún grado de descondensación), violeta oscuro (positivos, alto grado de descondensación). No se observaron diferencias significativas entre los tiempos de fijación tanto en las muestras con y sin DTT. En conclusión, se logró simplificar la técnica de AT y determinar los diferentes patrones en espermatozoides de llama. Se comprobó que la incubación con DTT se puede utilizar como control positivo de la técnica y para evaluar la susceptibilidad de cada individuo a la descondensación in vitro

Efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e do DNA de espermatozoides equinos após descongelação Effect of trolox and pentoxifylline on motility and integrity of, acrossome and DNA of equine spermatozoa after thawing

Três garanhões foram utilizados para estudar o efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e DNA de espermatozoides pós-descongelação. Para congelação, utilizou-se Tris-gema com glicerol (5%) em máquina de congelação de sêmen. As amostras foram descongeladas a 37ºC durante 30 segundos e tratadas com: T1= 150µL de sêmen + 150µL de Tris; T2= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 120µM/mL de trolox; T3= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina e T4= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina + 120µM/mL de trolox. Após 0, 60 e 120 minutos de incubação (37ºC), as amostras foram analisadas quanto à motilidade, vigor, integridade de acrossoma e DNA. Não houve diferença (P>0,05) entre tratamentos após 0 e 60 minutos de incubação em todos os parâmetros estudados. Após 120 minutos de incubação, verificou-se maior porcentual (P<0,05) de células com motilidade total e progressiva nas amostras do T2. Conclui-se que a adição de trolox após descongelação do sêmen equino preserva a motilidade total e progressiva dos espermatozoides submetidos à incubação a 37ºC durante 120 minutos.<br>Three stallions were used to study the effect of trolox and pentoxifylline addition on the motility and integrity of acrossome and DNA equine spermatozoa after thawing. Tris-egg-yolg diluent with glycerol (5%) were used to freeze the semen samples in a freezing machine. The samples were thawed at 37ºC during 30 seconds and treated with: T1=150µL of semen + 150µL of Tris; T2= 150µL of semen + 150µL of Tris +150mM/mL of trolox; T3= 150µL of semen + 150µL Tris +3.5mM of pentoxifylline; and T4= 150µL of semen + 150µL of Tris + 3.5mM of pentoxifylline + 150mM of trolox. After 0, 60, and 120 minutes of incubation (37ºC), the samples were analyzed to motility, vigor, and integrity of acrossome and DNA. There was no difference (P>0.05) among treatments considering 0 and 60 minutes of incubation in all studied parameters. After 120 minutes of incubation, it was observed higher percentage (P<0.05) of cells with total and progressive motility in the samples of T2. It can be concluded that the trolox addition after thawing of equine semen preserved total and progressive motility of the sperm incubated at 37ºC during 120 minutes

Viability and fertility of cooled equine semen diluted with skimmed milk or glycine egg yolk-based extenders

Two semen extenders were compared for their ability to maintain viability of horse semen during 24 hours of cold preservation, and for the pregnancy rate after artificial insemination. In the experiment 1, five ejaculates from three stallions were split-diluted in either a skimmed milk-based extender (Kenney extender) or a glycine egg yolk-based extender (Foote extender) and cooled at 6-8 ºC for 24 hours. Semen samples stored in Kenney extender for 24 hours had higher motility and spermatic vigor compared with those stored in Foote extender. However, samples stored in Foote extender had higher number of reactive sperm by hypoosmotic test and greater viability by epifluorescence test compared with those in Kenney extender. In the experiment 2, 17 and 23 ejaculates from two stallions were split-diluted with Kenney extender and Foote extender. The sperm concentration in each extender was adjusted to 500 million viable sperms per insemination dose. Semen was cooled to 6-8 ºC and stored for 24 hours. Seventy-four cycles of crossbred mares were inseminated with either semen diluted in Kenney extender or semen diluted in Foote extender. The pregnancy rate was higher from semen diluted in Kenney extender than that from semen in Foote extender (0.553 vs. 0.306). The Kenney extender is effective in preserving the motility, vigor and fertility of stallion semen after 24 hours of cold storage, whereas the Foote extender is not acceptable