Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death, by Costunolide

Background/Aims: The sesquiterpene lactone Costunolide is effective against various disorders including inflammation and malignancy. The substance is effective in part by triggering suicidal death or apoptosis of tumor cells. Mechanisms involved include altered function of transcription factors and mitochondria. Erythrocytes lack nuclei and mitochondria but are – in analogy to apoptosis of nucleated cells – able to enter suicidal erythrocyte death or eryptosis, characterized by cell shrinkage and cell membrane scrambling with phosphatidylserine translocation to the erythrocyte surface. Triggers of eryptosis include increase of cytosolic Ca2+ activity ([Ca2+]i), oxidative stress and ceramide. The present study explored, whether Costunolide induces eryptosis and, if so, to shed light on the mechanisms involved. Methods: Phosphatidylserine exposure at the cell surface was estimated from annexin-V-binding, cell volume from forward scatter, [Ca2+]i from Fluo3-fluorescence, reactive oxygen species (ROS) formation from 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein (DCF)-dependent fluorescence, and ceramide abundance utilizing specific antibodies. Results: A 48 hours exposure of human erythrocytes to Costunolide (15 µg/ml) significantly enhanced the percentage of annexin-V-binding cells, significantly decreased forward scatter and significantly increased Fluo3-fluorescence, DCF-fluorescence, and ceramide abundance. The effect of Costunolide on annexin-V-binding was significantly blunted by removal of extracellular Ca2+. Conclusion: Costunolide triggers cell shrinkage and phospholipid scrambling of the erythrocyte cell membrane, an effect at least in part due to Ca2+ entry and paralleled by oxidative stress and ceramide formation

Taurolidine Sensitivity of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death

Background/Aims: The taurine derivative Taurolidine is effective against diverse bacteria and tumor growth. In the treatment of cancer, the substance is effective in part by triggering suicidal death or apoptosis of tumor cells. The Taurolidine-induced apoptosis involves mitochondria. Erythrocytes lack mitochondria but are nevertheless able to enter suicidal erythrocyte death or eryptosis, which is characterized by cell shrinkage and cell membrane scrambling with phosphatidylserine translocation to the erythrocyte surface. Signaling of eryptosis includes increase of cytosolic Ca2+ activity ([Ca2+]i), oxidative stress and ceramide. The present study explores, whether Taurolidine induces eryptosis and, if so, which cellular mechanisms are involved. Methods: Phosphatidylserine exposure at the cell surface was estimated using annexin-V-binding, cell volume using forward scatter, [Ca2+]i using Fluo3-fuorescence, reactive oxygen species (ROS) formation using 2’,7’-dichlorodihydrofuorescein (DCF)-dependent fluorescence, and ceramide abundance using specific antibodies. Results: A 48 hours exposure of human erythrocytes to Taurolidine (60 µg/ml) significantly enhanced the percentage of annexin-V-binding cells, significantly decreased forward scatter and significantly increased Fluo3-fluorescence and ceramide abundance, but not DCF-fluorescence. The effect of Taurolidine on annexin-V-binding was virtually abrogated by removal of extracellular Ca2+. Conclusion: Taurolidine triggers cell shrinkage and phospholipid scrambling of the erythrocyte cell membrane, an effect at least in part due to Ca2+ entry and paralleled by increase of ceramide abundance

Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 and the response to cell stress

Expression of the serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) is up-regulated by several types of cell stress, such as ischemia, radiation and hyperosmotic shock. The SGK1 protein is activated by a signaling cascade involving phosphatidylinositide-3-kinase (PI3K), 3-phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1) and mammalian target of rapamycin (mTOR). SGK1 up-regulates Na+/K+-ATPase, a variety of carriers including Na+-,K+-,2Cl–– cotransporter (NKCC), NaCl cotransporter (NCC), Na+/H+ exchangers, diverse amino acid transporters and several glucose carriers such as Na+-coupled glucose transporter SGLT1. SGK1 further up-regulates a large number of ion channels including epithelial Na+ channel ENaC, voltage-gated Na+ channel SCN5A, Ca2+ release-activated Ca2+ channel (ORAI1) with its stimulator STIM1, epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6 and diverse K+ channels. Furthermore, SGK1 influences transcription factors such as nuclear factor kappa-B (NF-κB), p53 tumor suppressor protein, cAMP responsive element-binding protein (CREB), activator protein-1 (AP-1) and forkhead box O3 protein (FOXO3a). Thus, SGK1 supports cellular glucose uptake and glycolysis, angiogenesis, cell survival, cell migration, and wound healing. Presumably as last line of defense against tissue injury, SGK1 fosters tissue fibrosis and tissue calcification replacing energy consuming cells

Inhibition of Lithium Sensitive Orai1/ STIM1 Expression and Store Operated Ca2+ Entry in Chorea-Acanthocytosis Neurons by NF-κB Inhibitor Wogonin

Background/Aims: The neurodegenerative disease Chorea-Acanthocytosis (ChAc) is caused by loss-of-function-mutations of the chorein-encoding gene VPS13A. In ChAc neurons transcript levels and protein abundance of Ca2+ release activated channel moiety (CRAC) Orai1 as well as its regulator STIM1/2 are decreased, resulting in blunted store operated Ca2+-entry (SOCE) and enhanced suicidal cell death. SOCE is up-regulated and cell death decreased by lithium. The effects of lithium are paralleled by upregulation of serum & glucocorticoid inducible kinase SGK1 and abrogated by pharmacological SGK1 inhibition. In other cell types SGK1 has been shown to be partially effective by upregulation of NFκB, a transcription factor stimulating the expression of Orai1 and STIM. The present study explored whether pharmacological inhibition of NFκB interferes with Orai1/STIM1/2 expression and SOCE and their upregulation by lithium in ChAc neurons. Methods: Cortical neurons were differentiated from induced pluripotent stem cells generated from fibroblasts of ChAc patients and healthy volunteers. Orai1 and STIM1 transcript levels and protein abundance were estimated from qRT-PCR and Western blotting, respectively, cytosolic Ca2+-activity ([Ca2+]i) from Fura-2-fluorescence, SOCE from increase of [Ca2+]i following Ca2+ re-addition after Ca2+-store depletion with sarco-endoplasmatic Ca2+-ATPase inhibitor thapsigargin (1µM), as well as CRAC current utilizing whole cell patch clamp recording. Results: Orai1 and STIM1 transcript levels and protein abundance as well as SOCE and CRAC current were significantly enhanced by lithium treatment (2 mM, 24 hours). These effects were reversed by NFκB inhibitor wogonin (50 µM). Conclusion: The stimulation of expression and function of Orai1/STIM1/2 by lithium in ChAc neurons are disrupted by pharmacological NFκB inhibition

Role of the novel oncogene KDM2B in the epigenetic regulation of the cytoskeleton

To fit within the confines of the cell nucleus, DNA wraps around histones and folds to assume a higher order condensed structure termed chromatin. However, this condensation hinders important processes, such as transcription, replication, repair or recombination. Various covalent modifications on the histone proteins or the DNA itself, together with the active re-positioning of nucleosomes, regulate accessibility to the DNA. These modifications are functionally linked and cross-regulated, and their combination forms a code for the interpretation of the genetic information. Some of these modifications are transferred from mother to daughter cells or even from one generation of a multicellular organism to the next. These heritable alterations in chromatin that are not accompanied by changes in the DNA sequence are termed epigenetic, and are necessary for the temporal and spatial interpretation of the genome. Alterations in chromatin structure impact fundamental cellular processes and play a central role in human disease, and, in particular, cancer. In cancer, many physiological cellular activities are altered, resulting in uncontrolled cell proliferation, unrestricted survival, and pronounced defects in cellular morphogenesis. The latter plays a central role in conferring cancer cells with the inappropriate migratory and invasive characteristics that are important for the progression of the disease. In the metastatic process, cancer cells leave the primary tumor, and are disseminated throughout the body to seed secondary tumors at distant sites. In this process, epithelial cells lose their polarity and cell-cell adhesion, and gain migratory and invasive properties, in a process termed epithelial-mesenchymal transition (EMT), which involves a dramatic reorganization of the cytoskeleton accompanied by the formation of membrane protrusions required for invasive growth. Several lines of evidence suggest that the cytoskeleton is regulated by epigenetic mechanisms and alterations in chromatin regulators have now been linked to deregulated cytoskeletal functions. However, the detailed mechanisms behind these processes are only now beginning to emerge. The long term goal of this proposal will be the understanding of how chromatin regulation and epigenetic mechanisms influence the onset and progression of cancer. For this we will focus on the epigenetic regulation of one of the main cellular machineries involved in the metastatic process, the cytoskeleton. Our central hypothesis is that, in cancer, epigenetic alterations frequently result in the deregulation of the mechanisms maintaining normal cytoskeleton organization and function, which in turn promotes motility and invasiveness. To address this hypothesis, it is important to elucidate the chromatin factors that are involved in the regulation of the cytoskeleton, to decipher the epigenetic mechanisms by which these critical cellular factors regulate the expression of cytoskeleton genes, and to establish how these mechanisms contribute to tumor survival, invasiveness and migration. Actin cytoskeleton reorganization and signaling play an essential role in promoting cell movement, changing cell shape and establishing intracellular adhesion, and are thus implicated in malignant cell growth, transformation and invasion. Actin remodelling is accomplished by assembling multi-molecular complexes of structural and regulatory proteins at specific cell contact sites. Subsequently, actin filaments undergo elongation, branching, bundling, and depolymerization, leading to assembled superstructures. Actin-binding proteins are the mediators for these processes. The regulation of actin assembly and disassembly is under the control of complex signaling systems that link external signals to remodelling events, which result in altered cellular activities that adapt cell shape and/or behavior to suit new environmental conditions. During cancer progression key actin regulators, such as the members of the Rho GTPase family, become deregulated. To elucidate our hypothesis, we examined the effect of the chromatin regulator NDY1/KDM2B. The histone demethylase NDY1/KDM2B was isolated in a screen for novel oncogenes using retroviral insertion mutagenesis in rodents in 2008. KDM2B is downregulated during senescence in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), while ectopic expression of KDM2B enables MEFs to bypass replicative senescence by co-operating with PRC complexes in the repression the Ink4a-Arf-Ink4b locus. KDM2B represses the Ink4a-Arf-Ink4b locus by an elaborate mechanism. On the one hand, KDM2B expression counteracts the senescence-associated downregulation of EZH2, resulting in elevated global H3K27me3 levels. Increased trimethylation of H3K27 is also observed specifically in the Ink4a-Arf-Ink4b locus and results in the recruitment of PRC1 to the locus. In addition, KDM2B is specifically recruited to the Ink4a-Arf-Ink4b locus via a PRC1-type complex and it removes local H3K36me2 and H3K4me3 marks, marks that lead to transcriptional repression. KDM2B accelerates cell cycle progression and suppresses cell senescence during vitamin C-induced reprogramming by repressing the Ink4a-Arf-Ink4b locus and has also the capacity to promote iPSC generation in a vitamin C-independent manner, by co-operating with reprogramming factors Oct4, Sox2, and Klf4. This capacity depends on its demethylase and DNA-binding activities, but is largely independent of its role in antagonizing senescence. The function of KDM2B depends on its CxxC-ZF domain, which mediates its genome-wide binding to CpG islands. The histone demethylase KDM2B is an epigenetic factor with oncogenic properties that is regulated by the basic fibroblasts growth factor (FGF-2 or bFGF). FGF-2 is one of the 23 members of the FGF growth factor family. FGF-2 is produced by a variety of cell types and binds to the FGF receptors (primarily FGFR-1 and -2). In human cancer, FGF-2 is produced by the tumor cells or by the surrounding stroma and promotes tumor cell proliferation, migration, and invasiveness, as well as angiogenesis and the cycling of cancer stem cells. It has recently been shown that KDM2B co-operates with Polycomb Group proteins to promote cell migration and angiogenesis in tumors. The Polycomb group (PcG) proteins mediate epigenetic inheritance of silent and active chromatin states, are essential for normal development, and are implicated in cell proliferation, stem cell identity and cancer, genomic imprinting and X-inactivation. Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) contains the PcG proteins EZH2, which catalyzes the tri- and di- methylation of lysine 27 of histone H3 (H3K27). The H3K27me3 mark is specifically recognized by Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). The core of PRC1, of which many variants are thought to exist, contains BMI1 and KDM2B, polyhomeotic (Ph) and RING/RNF-type proteins. The RING/RNF proteins have ubiquitin E3 ligase activity that targets K119 of histone H2A. Ubiquitination of H2A appears to be a critical event in gene silencing. In our study, focusing on the role of KDM2B, we addressed its role in the epigenetic regulation of actin cytoskeleton signaling, cell-cell adhesion, cell growth, motility and migration of prostate and colon tumor cells and we elucidated the underlying mechanism. We have found that this histone demethylase play an important role in cell migration and result in major alterations of several proteins involved in cytoskeleton regulation, cell-cell adhesion and Ca2+ homeostasis. We report here that KDM2B is functionally expressed in DU-145 prostate and HCT-116 colon cancer cells and it is activated by FGF-2. KDM2B regulates the PRC proteins EZH2 and BMI1, resulting in the up-regulation or down-regulation of gene transcription and protein expression of the protein upon overexpression or knockdown of KDM2B, respectively. Also, KDM2B knockdown induced potent up-regulation of gene transcription and protein expression of the epithelial markers E-Cadherin and ZO-1, while KDM2B overexpression down-regulated the levels of both markers, suggesting control of cell adhesion by KDM2B. The opposite was obvious for the mesenchymal marker N-Cadherin in colon cancer cells. Knockdown of this epigenetic factor induced potent down-regulation of the protein levels of N-Cadherin and on the other hand, KDM2B overexpression upregulated the mesenchymal marker, suggesting control of EMT by KDM2B. These results establish a clear functional role of the epigenetic factor KDM2B in the regulation of EMT in colon tumor cells and further support the recently postulated oncogenic role of this histone demethylase in various tumors. In addition, RhoA, RhoB and RhoC protein levels diminished upon KDM2B-knockdown, while all three small GTPases became upregulated in KDM2B-overexpressing DU-145 and HCT-116 cell clones. While the transcription levels of the three small GTPases remained unchanged, RhoA and RhoB activity were diminished upon KDM2B-knockdown and upregulated in KDM2B-overexpressing cell clones. Interestingly, Rac1 GTPase levels increased upon KDM2B-knockdown and diminished in KDM2B-overexpressing HCT-116 colon tumor- and DU-145 prostate cancer cells. In accordance, actin reorganization with formation of stress fibers became evident in KDM2B-overexpressing cells and abolished in the presence of the Rho inhibitor C3 transferase. Furthermore, DU-145 cell migration was significantly enhanced in KDM2B overexpressing cells and abolished in C3-pretreated cells. Conversely, the retardation of cell migration observed in KDM2B knockdown cells was enhanced in C3-pretreated cells. Besides Rho-GTPases signaling, we have further analyzed whether KDM2B may as well control additional signaling effectors that regulate actin reorganization, cell growth and motility. For this reason, we have focused on the FAK/PI3K metabolic pathway and we analyzed the underlying mechanism upon silencing and/or overexpression of KDM2B. KDM2B overexpression or silencing controls the activity of FAK in DU-145 prostate- and HCT-116 colon-tumor cells without affecting gene transcription and protein expression of this kinase. Upon KDM2B overexpression in DU-145 cells, significantly enhanced migration was observed, which was abolished in cells pretreated by the specific phosphoinositide-3 kinase (PI3K) inhibitor LY294002, implying involvement of FAK/PI3K signaling in the migration process. In line with this, the p85-PI3K-subunit was downregulated upon knockdown of KDM2B in DU-145 cells, while the opposite effect became evident in KDM2B-overexpressing cells. On the other hand, expression and activation of the FAK/PI3K-downstream acting pro-survival kinases AKT and SGK1 were not changed. Short-term proliferation of DU-145 cells remained unaffected upon overexpression or knockdown of KDM2B, an observation being in line with the observed, unaltered expression and activation profiles of the pro-survival kinases AKT and SGK1. These results uncover novel molecular targets namely FAK and PI3K and revealed a novel functional role of KDM2B in regulating the activation of the FAK/PI3K signaling in prostate and colon cancer cells that participates in the control of cell motility without affecting cell proliferation. Last, we examined the effect of KDM2B in Ca2+ homeostasis. KDM2B overexpression in DU-145 cells, induced potent up-regulation of gene transcription of Orai1 and Stim1 and regulated Store Operated Calcium Entry (SOCE). These results revealed a novel functional role of KDM2B in regulating FAK/PI3K signaling and Ca2+ homeostasis in prostate cancer cells. The results of this study, establish for the first time a clear functional link between the epigenetic factor KDM2B and the regulation of cell-cell adhesion, Rho-GTPases signaling, FAK/PI3K signaling and Ca2+ homeostasis that in turn controls actin cytoskeleton reorganization and cell migration. The chromatin factor KDM2B regulates cell motility via four at least different metabolic pathways; though actin cytoskeleton organization and RhoGTPases signaling, FAK/PI3K pathway and Ca2+ entry. Our findings imply that in tumor cells, chromatin regulators may contribute to tumor growth by controlling expression and function of cytoskeletal and cell-cell adhesion genes, invasiveness and migration and establish a clear mechanistic link, how alterations in epigenetic factors may lead to deregulated cytoskeletal functions.Ο καρκίνος δεν oφείλεται μόνο σε γενετικά αίτια. Μη-γενετικές κληρονομικές αλλαγές που επηρεάζουν την δομή της χρωματίνης και την έκφραση των γονιδίων, μπορούν επίσης να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου. Μέχρι τώρα, έρευνες δείχνουν ότι αλλαγές στους ρυθμιστές της χρωματίνης, όπως είναι μεθυλοτρανσφεράσες και οι απομεθυλάσες των ιστονών, μπορούν να απορρυθμίσουν τις λειτουργίες του κυτταροσκελετού και της διακυτταρικής προσκόλλησης, καθώς και να συμμετάσχουν στη διαδικασία της μετάστασης. Στον καρκίνο, πολλές φυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες μεταβάλλονται, με αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη δυνατότητα ενισχυμένης επιβίωσης και το διαφοροποιημένο κυτταρικό σχήμα. Η ελαττωματική κυτταρική μορφογένεση παρέχει στα καρκινικά κύτταρα τα χαρακτηριστικά εκείνα που τους προσδίδουν αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα και διηθητικότητα, χαρακτηριστικά απαραίτητα για την εξέλιξη της νόσου. Κατά τη μεταστατική διαδικασία, τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την πολικότητα τους και τη διακυτταρική προσκόλληση και αποκτούν μεσεγχυαμτικά χαρακτηριστικά, σε μια διαδικασία που ονομάζεται επιθηλιακή- μεσεγχυματική μετάβαση (EMT). Κατά την ΕΜΤ, παρατηρείται μία δραματική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, η οποία συνοδεύεται από το σχηματισμό μεμβρανικών προεξοχών. Πολλά ευρήματα μέχρι στιγμής, υποδηλώνουν ότι ο κυτταροσκελετός της ακτίνης ρυθμίζεται από διάφορους επιγενετικούς μηχανισμούς. Επιπλέον, αλλοιώσεις των ρυθμιστών της χρωματίνης έχουν συνδεθεί με απορρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών του κυττάρου. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί πίσω από αυτές τις διαδικασίες δεν είναι ευρέως γνωστοί. Στόχος της συγκεκριμένης μελέτης είναι η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η ρύθμιση της χρωματίνης και οι επιγενετικοί μηχανισμοί επηρεάζουν την εμφάνιση και την εξέλιξη του καρκίνου. Για το λόγο αυτό, επικεντρωθήκαμε στην επιγενετική ρύθμιση ενός από τα κυριότερα κυτταρικά συστήματα που εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία, τον κυτταροσκελετό. Η βασική μας υπόθεση είναι ότι, στον καρκίνο, οι επιγενετικές αλλοιώσεις συχνά οδηγούν στην απορρύθμιση των μηχανισμών που διατηρούν την φυσιολογική οργάνωση και λειτουργία του κυτταροσκελετού, γεγονός που με τη σειρά του προάγει την κινητικότητα και την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να διασαφηνίσουμε την υπόθεσή μας, εξετάσαμε την επίδραση του ρυθμιστή της χρωματίνης KDM2B. Το γονίδιο KDM2B κωδικοποιεί για μία ειδική απομεθυλάση ιστονών που στοχεύει τη τριμεθυλιωμένη λυσίνη Κ4 και τη διμεθυλιωμένη λυσίνη Κ36 της ιστόνης Η3 (H3K4me3 και H3K36me2), σημάδια που οδηγούν σε μεταγραφική καταστολή. Απομονώθηκε σε μία μελέτη για προσδιορισμό νέων ογκογονιδίων, έπειτα από πρόκληση μεταλλαξογένεσης μέσω ένθεσης ρετροϊών στο γονιδίωμα τρωκτικών. Η λειτουργία της εξαρτάται από την περιοχή CxxC-ZF της αλληλουχίας της, η οποία διαμεσολαβεί τη δέσμευσή της σε μη μεθυλιωμένες CpG νησίδες κατά μήκος όλου του γονιδιώματος. Εκτοπική έκφραση της KDM2B οδηγεί τους εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικιών (MEFs) σε αθανατοποίηση παρακάμπτοντας τη διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης (senescence), μέσω ενός πολύπλοκου μηχανισμού κατά τον οποίο συνεργάζονται τα σύμπλοκα καταστολής γονιδίων PRC. Ο μηχανισμός αυτός οδηγεί στην καταστολή του γονιδιακού τόπου Ink4a-Arf-Ink4b και περιλαμβάνει τη δράση της μεθυλοτρανσφεράσης EZH2, που είναι μέλος του PRC2 συμπλόκου και καταλύει τη δι- και την τρι-μεθυλίωση της λυσίνης Κ27 (H3K27), σημάδι που αναγνωρίζεται από το PRC1 σύμπλοκο, το οποίο περιλαμβάνει την KDM2B. Στη μελέτη μας, εστιάζοντας στο ρόλο του επιγενετικού παράγοντα KDM2B, αποσαφηνίσαμε το ρόλο του στην επιγενετική ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, τη διακυτταρική προσκόλληση, την κυτταρική ανάπτυξη, την κινητικότητα και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη DU-145 και των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου HCT-116. Ειδικότερα, στις κυτταρικές αυτές σειρές, οι οποίες εκφράζουν είτε ένα ειδικό shKDM2B έναντι της KDM2B είτε υπερεκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο, βρήκαμε ότι η απομεθυλάση αυτή των ιστονών διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων και οδηγεί στη διαφορετική έκφραση αρκετών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταροσκελετού, τη διακυτταρική προσκόλληση και την ομοιόσταση του Ca2+. Συγκεκριμένα, η KDM2B εκφράζεται λειτουργικά και στις δύο κυτταρικές σειρές και ενεργοποιείται από τον FGF-2. Επιπλέον, ρυθμίζει τις πρωτεΐνες των PRC συμπλόκων EZH2 και BMI1, αυξάνοντας την έκφρασή τους τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης έπειτα από την υπερέκφραση της, ενώ αντίθετα οδηγεί στη μείωση των επιπέδων τους μετά την αποσιώπησή της. Η αποσιώπηση της KDM2B προκάλεσε ισχυρή αύξηση της έκφρασης των επιθηλιακών δεικτών E-Καδερίνης και ZO-1, ενώ η υπερέκφραση της KDM2B μείωσε τα επίπεδά τους. Αντίθετο πρότυπο έκφρασης παρουσίασε ο μεσεγχυματικός δείκτης N-Καδερίνη, υποδεικνύοντας τον έλεγχο της EMT από την KDM2B. Αυτά τα αποτελέσματα καθιερώνουν έναν σαφή λειτουργικό ρόλο του επιγενετικού παράγοντα KDM2B στη ρύθμιση της ΕΜΤ στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου και περαιτέρω υποστηρίζουν τον ογκογονικό ρόλο αυτής της απομεθυλάσης των ιστονών σε διάφορους όγκους. Επίσης παρατηρήσαμε μία σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας των Rho GTPασών. Ειδικότερα, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των RhoA, RhoB και RhoC μειώθηκαν έπειτα από την αποσιώπηση την KDM2B, ενώ και οι τρεις μικρές GTPάσες αυξήθηκαν στους κυτταρικούς κλώνους DU-145 και HCT-116 που υπερεκφράζουν KDM2B. Ενώ τα επίπεδα μεταγραφής των τριών μικρών GTPασών παρέμειναν αμετάβλητα, η δραστικότητα των RhoA και RhoB ελαττώθηκε στους κλώνους με αποσιωποιημένη της έκφραση της KDM2B ενώ αυξήθηκε στους κυτταρικούς κλώνους που υπερεκφράζουν KDM2B. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επίπεδα της Rac1 GTPάσης εμφάνισαν αντίθετο πρότυπο έκφρασης από αυτή των μικρών Rho GTPασών, όντας αυξημένα στους κυτταρικούς κλώνους με αποσιωποιημένο τον επιγενετικό παράγοντα και μειωμένα στα κύτταρα με υπερεκφρασμένη την KDM2B. Η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης έγινε επίσης εμφανής, με σχηματισμό ινιδίων του στρες σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την KDM2B. Η αναδιοργάνωση αυτή δεν πραγματοποιήθηκε παρουσία της τρανσφεράσης C3 του αναστολέα των Rho. Επιπλέον, κύτταρα DU-145 που υπερεκφράζουν την KDM2B εμφάνισαν αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα, η οποία μειώθηκε παρουσία του αναστολέα της τρανσφεράσης C3. Η επιβράδυνση της κυτταρικής μετανάστευσης που παρατηρήθηκε σε κύτταρα με αποσιωποιημένη KDM2B, ενισχύθηκε ακόμα παραπάνω όταν προ-επωάστηκαν με τον αναστολέα αυτό, υποδηλώνοντας συμμετοχή σηματοδότησης των Rho-GTPασών στη διαδικασία της μετανάστευσης. Εκτός από τη σηματοδότηση μέσω των Rho-GTPασών, αναλύσαμε περαιτέρω εάν η KDM2B μπορεί να ελέγξει πρόσθετους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αναδιοργάνωση της ακτίνης, την κυτταρική ανάπτυξη και κινητικότητα. Για το λόγο αυτό, εστιάσαμε στο μεταβολικό μονοπάτι σηματοδότησης FAK/PI3K και αναλύσαμε τον υποκείμενο μηχανισμό κατά την αποσιώπηση ή/και την υπερέκφραση της KDM2B. Η υπερέκφραση ή η σίγηση της απομεθυλάσης ελέγχει τη δραστικότητα της κινάσης FAK στα κύτταρα, χωρίς ωστόσο να επηρεάζει τη γονιδιακή μεταγραφή ή την πρωτεϊνική έκφραση αυτής της κινάσης. Μετά την υπερέκφραση της KDM2B σε κύτταρα DU-145, παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων αυτών, η οποία ανεστάλη όταν τα κύτταρα αυτά προ-επωάστηκαν με τον αναστολέα της φωσφοϊνοσιτίνης-3 κινάσης (PI3K) LY294002, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή του FAK/PI3K σηματοδοτικού μηχανισμού στη διαδικασία της μετανάστευσης. Σε συμφωνία με αυτό, τα πρωτεϊνικά επίπεδα της υπομονάδας p85-ΡΙ3Κ αυξήθηκαν έπειτα από την υπερέκφραση της KDM2B, ενώ το αντίθετο έγινε εμφανές στα κύτταρα με αποσιωποιημένο το εν λόγω γονίδιο. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση και η ενεργοποίηση των μορίων καθοδικά των FAK/PI3K, ΑΚΤ και SGK1 δεν παρουσίασαν κάποια μεταβολή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων DU-145 παρέμεινε ανεπηρέαστος από την υπερέκφραση ή την αποσιώπηση της KDM2B, μια παρατήρηση που συνάδει με τα παρατηρούμενα αμετάβλητα επίπεδα έκφρασης και ενεργοποίησης των κινασών ΑΚΤ και SGK1. Από τα αποτελέσματα αυτά, προκύπτουν νέοι μοριακοί στόχοι (FAK και ΡΙ3Κ) και αποκαλύπτεται ένας νέος λειτουργικός ρόλος της KDM2B στη ρύθμιση της ενεργοποίησης και της σηματοδότησης μέσω FAK/ΡΙ3Κ. Τέλος, εξετάσαμε και την επίδραση της KDM2B στην ομοιόσταση του Ca2+. Υπερέκφραση της KDM2B στα κύτταρα DU-145 οδήγησε σε αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων Orai1 και Stim1, ενώ αντίθετα μειώθηκαν έπειτα από την αποσιώπηση του γονιδίου. Επιπλέον σημαντική ήταν και η αλλαγή στην απελευθέρωση του ασβεστίου από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν το γονίδιο της KDM2B σε σύγκριση με τα κύτταρα αναφοράς. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης μας, καθιερώνουν για πρώτη φορά μια σαφή λειτουργική σχέση μεταξύ του επιγενετικού παράγοντα KDM2B και της ρύθμισης της διακυτταρικής προσκόλλησης των κυττάρων, της σηματοδότησης μέσω Rho-GTPασών, της σηματοδότησης μέσω των κινασών FAK/PI3K και της ομοιοστασίας του Ca2+, που με τη σειρά τους ελέγχουν την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και τη μετανάστευση των κυττάρων. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι στα καρκινικά κύτταρα, οι ρυθμιστές της χρωματίνης μπορούν να συμβάλλουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ογκογένεσης με τον έλεγχο της έκφρασης και της λειτουργίας γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταροσκελετό, τη διακυτταρική προσκόλ

The Epigenetic Factor KDM2B Regulates EMT and Small GTPases in Colon Tumor Cells

Background/Aims: The epigenetic factor KDM2B is a histone demethylase expressed in various tumors. Recently, we have shown that KDM2B regulates actin cytoskeleton organization, small Rho GTPases signaling, cell-cell adhesion and migration of prostate tumor cells. In the present study, we addressed its role in regulating EMT and small GTPases expression in colon tumor cells. Methods: We used RT-PCR for the transcriptional analysis of various genes, Western blotting for the assessment of protein expression and immunofluorescence microscopy for visualization of fluorescently labeled proteins. Results: We report here that KDM2B regulates EZH2 and BMI1 in HCT116 colon tumor cells. Knockdown of this epigenetic factor induced potent up-regulation of the protein levels of the epithelial markers E-cadherin and ZO-1, while the mesenchymal marker N-cadherin was downregulated. On the other hand, KDM2B overexpression downregulated the levels of both epithelial markers and upregulated the mesenchymal marker, suggesting control of EMT by KDM2B. In addition, RhoA, RhoB and RhoC protein levels diminished upon KDM2B-knockdown, while all three small GTPases became upregulated in KDM2B-overexpressing HCT116 cell clones. Interestingly, Rac1 GTPase level increased upon KDM2B-knockdown and diminished in KDM2B-overexpressing HCT116 colon tumor- and DU-145 prostate cancer cells. Conclusions: These results establish a clear functional role of the epigenetic factor KDM2B in the regulation of EMT and small-GTPases expression in colon tumor cells and further support the recently postulated oncogenic role of this histone demethylase in various tumors

Decreased Na+/K+ ATPase Expression and Depolarized Cell Membrane in Neurons Differentiated from Chorea-Acanthocytosis Patients

Loss of function mutations of the chorein-encoding gene VPS13A lead to chorea-acanthocytosis (ChAc), a neurodegenerative disorder with accelerated suicidal neuronal cell death, which could be reversed by lithium. Chorein upregulates the serum and glucocorticoid inducible kinase SGK1. Targets of SGK1 include the Na(+)/K(+)-ATPase, a pump required for cell survival. To explore whether chorein-deficiency affects Na(+)/K(+) pump capacity, cortical neurons were differentiated from iPSCs generated from fibroblasts of ChAc patients and healthy volunteers. Na(+)/K(+) pump capacity was estimated from K(+)-induced whole cell outward current (pump capacity). As a result, the pump capacity was completely abolished in the presence of Na(+)/K(+) pump-inhibitor ouabain (100 µM), was significantly smaller in ChAc neurons than in control neurons, and was significantly increased in ChAc neurons by lithium treatment (24 hours 2 mM). The effect of lithium was reversed by SGK1-inhibitor GSK650394 (24 h 10 µM). Transmembrane potential (V(m)) was significantly less negative in ChAc neurons than in control neurons, and was significantly increased in ChAc neurons by lithium treatment (2 mM, 24 hours). The effect of lithium on V(m) was virtually abrogated by ouabain. Na(+)/K(+) α1-subunit transcript levels and protein abundance were significantly lower in ChAc neurons than in control neurons, an effect reversed by lithium treatment (2 mM, 24 hours). In conclusion, consequences of chorein deficiency in ChAc include impaired Na(+)/K(+) pump capacity