Microrganismos endofíticos e a cultura de tecidos vegetais: quebrando paradigmas

Plant tissue culture has been an important tool widely used for various purposes. Within this context, the term axenic plant has been taken as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on methods that effectively eliminate any microorganisms that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro.A cultura de tecidos vegetais tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades. Neste contexto, o termo plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca de métodos que eliminem de forma eficaz todo e qualquer microrganismo que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois muitos trabalhos mostram que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro

Ecological anatomy of Eugenia glazioviana Kiaersk leaf (Myrtaceae)

Dos mecanismos com potencial valor adaptativo em resposta ao estresse hídrico merece destaque o apresentado por Eugenia glazioviana Kiaersk cuja perda de turgescência foliar e consequente curvatura do limbo da posição horizontal para a vertical, sem a abscisão das folhas, que estão associados à redução da superfície foliar exposta à luz solar. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo a caracterização histológica da folha da espécie, visando compreender melhor esse mecanismo de resposta ao estresse hídrico. Para tanto foram realizados cortes transversais e paradérmicos da lâmina foliar, bem como, cortes transversais do pecíolo, sendo estes analisados e as imagens capturadas em microscópio de luz. Os resultados permitem, entre outras coisas, afirmar que E. glazioviania possui características tipicamente xerofíticas, sendo elas: cutícula espessa em ambas as superfícies, folha hipoestomática, com muitos tricomas tectores na face abaxial, além de uma característica que pode ser exclusiva da espécie e que possivelmente justifique tal resposta, a qual relaciona-se a presença de ductos glandulares, que percorrem toda a extensão do pecíolo, em continuidade com a lâmina foliar.In response to hydrous stress, the adaptive mechanisms with a potential adaptive value presented by Eugenia glazioviana Kiaersk is notable, whose leaf turgidity loss and the blade consequent curvature from the horizontal to vertical position, without the leaves abscission, are associated with the reduction of the leaf surface exposed to sunlight. This study aimed to characterize histological leaf species to better understand the mechanism in response to hidrous stress. Therefore, we performed transverse and paradermal cuts from the leaf blade and petiole cross-sections. They were analyzed and the images were captured under light microscope. Among other things, the results allowed to state that E. glazioviana has typically xerophytic characteristics, namely: thick cuticle on both surfaces, hypostomatic leaves with many trichomes on the abaxial side, and a characteristic that may be unique to that species and possibly justify such response, which is related to the glandular ducts presence, running the petiole length in continuity with the leaf blade

Study of endophytic bacterial community and its manifestation in the micropropagation of Eucalyptus benthamii

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica.Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic

Investigation of ubiquitous endophytic microbiota in \"axenic\" microplants.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais.Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species