Caractérisation fonctionnelle de BamB, protéine impliquée dans la biogenèse de la membrane externe et la virulence de <em>Salmonella</em>

La protéine BamB est une lipoprotéine de membrane externe appartenant au complexe BAM (beta-Barrel Assembly Machinery) et impliquée dans l'assemblage des protéines de membrane externe (PME), la sensibilité aux antibiotiques, le contrôle de l'expression des trois systèmes de sécrétion de type III (T3SS) et la virulence de Salmonella. Chez E. coli, au sein du complexe BAM, elle interagit directement avec la protéine BamA. De plus, chez cette bactérie, BamB présente une activité sérine-thréonine kinase. Afin de mieux caractériser le rôle de BamB, nos objectifs ont été d’étudier (1) l'impact de l’altération de l'interaction de BamB avec le complexe BAM ou de sa séquestration dans le cytoplasme sur }'ensemble des rôles décrits de BamB et (2) l’activité kinase putative de BamB chez Salmonella. Nos résultats montrent que certains rôles de BamB sont dissociables entre eux et que l'interaction BamA/BamB n'est pas requise pour le rôle de BamB dans le contrôle de l'expression des T3SS, la virulence de Salmonella et l'assemblage des PME à la membrane externe. Aucune activité kinase ni aucune activité cytoplasmique de la protéine n'a pu être formellement démontrée

Functional caracterization of BamB, a protein involved in outer-membrane biogenesis and Salmonella virulence

La protéine BamB est une lipoprotéine de membrane externe appartenant au complexe BAM (β-Barrel Assembly Machinery) et impliquée dans l’assemblage des protéines de membrane externe (PME), la sensibilité aux antibiotiques, le contrôle de l’expression des trois systèmes de sécrétion de type III (T3SS) et la virulence de Salmonella. Chez E. coli, au sein du complexe BAM, elle interagit directement avec la protéine BamA. De plus, chez cette bactérie, BamB présente une activité sérine-thréonine kinase. Afin de mieux caractériser le rôle de BamB, nos objectifs ont été d’étudier (1) l’impact de l’altération de l’interaction de BamB avec le complexe BAM ou de sa séquestration dans le cytoplasme sur l’ensemble des rôles décrits de BamB et (2) l’activité kinase putative de BamB chez Salmonella. Nos résultats montrent que certains rôles de BamB sont dissociables entre eux et que l’interaction BamA/BamB n’est pas requise pour le rôle de BamB dans le contrôle de l’expression des T3SS, la virulence de Salmonella et l’assemblage des PME à la membrane externe. Aucune activité kinase ni aucune activité cytoplasmique de la protéine n’a pu être formellement démontrée.BamB is an outer-membrane lipoprotein belonging to the BAM complex (β-Barrel Assembly Machinery). In Salmonella, it is involved in the assembly of outer membrane proteins (OMP), in antibiotic susceptibility, in the transcriptional control of the three Type-Three-Secretion-Systems (T3SS) related genes and also in virulence. In E. coli, BamB interacts directly with the BamA protein. Moreover, BamB has been shown to have a serine-threonin kinase activity in this bacterium. In order to better characterize the roles of the BamB protein, our purposes were to study (1) the impact of the alteration of the interaction of BamB with the BAM complex or of its cytoplasmic sequestration and (2) its putative kinase activity in Salmonella. Our results show that some of the BamB roles are dissociable and that the BamA/BamB interaction is not required for T3SS expression, Salmonella virulence or OMP assembly in the outer membrane. Currently, neither a kinase activity nor a cytoplasmic activity has been clearly demonstrated for this protein

Salmonella enterica

Chapitre 16Salmonella enteric

Deciphering the role of BamA-BamB interaction in T3SS expression and virulence in <em>Salmonella</em>

National audienc

Rôle de BamB et son interaction avec BamA dans la biogenèse de la membrane externe, l’expression des T3SS et la virulence chez <em>Salmonella</em>

National audienceLe repliement puis l’insertion des protéines à tonneaux β dans la membrane externe des bactéries est medié par le complexe Bam constitué par la protéine centrale BamA et par 4 lipoprotéines BamB-BamE. BamB interagit directement avec BamA et est impliquée dans plusieurs processus biologiques : l’assemblage des protéines de membrane externe (OMPs) et la perméabilité, le contrôle de l’expression de systèmes de sécrétion de type 3 (T3SS) et enfin la virulence chez Salmonella en modèles murin et aviaire. Pour déterminer s’il existe une relation entre ces différentes fonctions et si l’interaction entre BamB et BamA est requise pour chacune d’elle, des plasmides contenant des mutations ponctuelles dans bamB ont été introduits dans un mutant ΔbamB de Salmonella. Nous démontrons que l’association de résidus L173, L175 et R176 est essentielle à tous les rôles de BamB et à son interaction avec BamA. De plus, des résultats obtenus avec le variant BamB D229A qui est incapable d’immunoprécipiter BamA montrent que l’interaction entre BamA et BamB n’est pas requise pour l’assemblage des OMPs, l’expression des T3SS et la virulence. Enfin le variant BamB D227A restore complétement la virulence du mutant ΔbamB mais conserve les mêmes défauts de perméabilité membranaire que ce dernier indiquant que le défaut de virulence du mutant n’est pas relié à sa sensibilité accrue aux antimicrobiens. En conclusion, au moins certains rôles de BamB sont dissociables et l’association de BamB avec les complexe Bam n’est pas indispensable à son activité. Par ailleurs, de part leur essentialité, les résidus L173, L175 et R176 constituent un site privilégié pour le développement d’inhibiteurs de BamB comme alternative thérapeutique aux antibiotiques

Deciphering the roles of BamB and its interaction with BamA in outer membrane biogenesis, T3SS expression and virulence in Salmonella.

The folding and insertion of β-barrel proteins in the outer membrane of Gram-negative bacteria is mediated by the BAM complex, which is composed of the outer membrane protein BamA and four lipoproteins BamB to BamE. In Escherichia coli and/or Salmonella, the BamB lipoprotein is involved in (i) β-barrel protein assembly in the outer membrane, (ii) outer membrane permeability to antibiotics, (iii) the control of the expression of T3SS which are major virulence factors and (iv) the virulence of Salmonella. In E. coli, this protein has been shown to interact directly with BamA. In this study, we investigated the structure-function relationship of BamB in order to assess whether the roles of BamB in these phenotypes were inter-related and whether they require the interaction of BamB with BamA. For this purpose, recombinant plasmids harbouring point mutations in bamB were introduced in a ΔSalmonella bamB mutant. We demonstrated that the residues L173, L175 and R176 are crucial for all the roles of BamB and for the interaction of BamB with BamA. Moreover, the results obtained with a D229A BamB variant, which is unable to immunoprecipitate BamA, suggest that the interaction of BamB with BamA is not absolutely necessary for BamB function in outer-membrane protein assembly, T3SS expression and virulence. Finally, we showed that the virulence defect of the ΔbamB mutant is not related to its increased susceptibility to antimicrobials, as the D227A BamB variant fully restored the virulence of the mutant while having a similar antibiotic susceptibility to the ΔbamB strain. Overall, this study demonstrates that the different roles of BamB are not all inter-related and that L173, L175 and R176 amino-acids are privileged sites for the design of BamB inhibitors that could be used as alternative therapeutics to antibiotics, at least against Salmonella

Multiplicity of Salmonella entry mechanisms, a new paradigm for Salmonella pathogenesis

Work on the new invasion routes has been funded by the Région Centre. N. Abed holds a Post-Doctoral fellowship funded and performed within the “SAVIRE” project, funded by the Délégation Régionale à la Recherche et à la Technologie du Centre (FEDER) number 1634-32245 and by the Région Centre number 2008-00036085. F. Namdari holds a DoctorInternational audienceThe Salmonella enterica species includes about 2600 diverse serotypes, most of which cause a wide range of food- and water-borne diseases ranging from self-limiting gastroenteritis to typhoid fever in both humans and animals. Moreover, some serotypes are restricted to a few animal species, whereas other serotypes are able to infect plants as well as cold- and warm-blooded animals. An essential feature of the pathogenicity of Salmonella is its capacity to cross a number of barriers requiring invasion of a large variety of phagocytic and nonphagocytic cells. The aim of this review is to describe the different entry pathways used by Salmonella serotypes to enter different nonphagocytic cell types. Until recently, it was accepted that Salmonella invasion of eukaryotic cells required only the type III secretion system (T3SS) encoded by the Salmonella pathogenicity island-1. However, recent evidence shows that Salmonella can cause infection in a T3SS-1-independent manner. Currently, two outer membrane proteins Rck and PagN have been clearly identified as Salmonella invasins. As Rck mediates a Zipper-like entry mechanism, Salmonella is therefore the first bacterium shown to be able to induce both Zipper and Trigger mechanisms to invade host cells. In addition to these known entry pathways, recent data have shown that unknown entry routes could be used according to the serotype, the host and the cell type considered, inducing either Zipper-like or Trigger-like entry processes. The new paradigm presented here should change our classic view of Salmonella pathogenicity. It could also modify our understanding of the mechanisms leading to the different Salmonella-induced diseases and to Salmonella-host specificity

Overview of phenotypic traits of S. Enteritidis LA5ΔbamB mutant strains expressing BamB proteins with point mutations.

<p>Overview of phenotypic traits of S. Enteritidis LA5ΔbamB mutant strains expressing BamB proteins with point mutations.</p

Influence of <i>bamB</i> point mutations on outer-membrane protein level.

<p>After culture in LB broth, total membrane proteins of the <i>S.</i> Enteritidis wild-type strain LA5, the LA5Δ<i>bamB</i> mutant, or the LA5Δ<i>bamB</i> mutant expressing BamB variants were extracted. Membrane proteins were analyzed by 12% SDS-PAGE and either stained with colloidal Coomassie brilliant blue G250 (A) or transferred onto a nitrocellulose membrane and probed with an anti-OmpA serum (B). The positions of OmpC/F, OmpD and OmpA are indicated. Results shown are representative of at least three independent culture and protein extractions.</p

Effect of amino-acid substitutions in BamB proteins on the interaction of BamB with BamA.

<p>Co-immunoprecipitation of BamA with histidine-tagged BamB proteins was performed. Whole-cell lysates of the <i>S.</i> Enteritidis LA5Δ<i>bamB</i> mutant or the LA5Δ<i>bamB</i> mutant expressing wild-type BamB protein, BamB with the single L173S, R176A, D227A, D229A substitution or the triple-mutated L173S,L175S,R176A BamB protein were immunoprecipitated with (+) or without (−) polyclonal anti-BamB antibodies. Immunoprecipitated proteins were separated by SDS-PAGE, transferred onto a nitrocellulose membrane and the presence of BamB or BamA in the samples was visualized by western-blots using polyclonal anti-BamB or anti-BamA antibodies. Hc: immunoglobulin G heavy chain. These results are representative of three independent experiments.</p