Effects of w-ACTX-Hv1a/GNA, a novel protein biopesticide targeting voltage-gated calcium ion channels, on target and non-target arthropod species

PhD ThesisAn increasing human population is met with the challenge of feeding over 10 billion people by 2050. Nowadays, over 20% of crop production is lost to insect pests. Chemical control agents, in general, present broad-spectrum activity, killing both pests and beneficial organisms that would contribute to production (i.e. pollinators and natural enemies). Previously, the insecticidal voltage-gated calcium channel blocker peptide ω-ACTX-Hv1a (Hv1a) was linked to the ‘carrier’ molecule snowdrop lectin (GNA). The resulting fusion protein, Hv1a/GNA, is highly toxic towards lepidopteran and coleopteran pests, presenting potential for use as a biopesticide. Here, the fusion protein was shown to also be toxic to the hemipteran pests Sitobion avenae and Myzus persicae, via artificial diet and when expressed in transgenic plants. However, its effects on non-target arthropods have not been previously evaluated. Therefore, toxicity of Hv1a/GNA was tested against two beneficial insects, the parasitoid wasp Eulophus pennicornis via its host, Lacanobia oleracea, and the honeybee Apis mellifera. The fusion protein did not present any significant tri-trophic negative effects on E. pennicornis, even when injected into host larvae. Honeybee survival was slightly affected when fed on high doses of fusion protein representing a ‘worst-case scenario’, but lead to no detectable effects when dosed with field-relevant levels. The fact that bees internalized Hv1a/GNA led to the hypothesis that the haemolymph-feeding parasitic mite Varroa destructor would be affected by the fusion protein. However, mites were able to digest the protein and hence no effects were recorded. Further attempts to target calcium channels in M. persicae and Tribolium castaneum via RNAi were made. Whilst there were no phenotypic effects, gene expression was down-regulated in T. castaneum. This study shows that Hv1a/GNA is a specific biopesticide, posing low risks against beneficial non-target organisms while being toxic to selected insect pests

Impact of Bt cotton on the population dynamics of the cotton aphid in greenhouse

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo experimental para avaliar o impacto do algodoeiro Bt na bionomia e na escolha de plantas para colonização pelo pulgão-do-algodoeiro (Aphis gossypii). A bionomia do pulgão foi avaliada em casa de vegetação com insetos criados em gaiolas individuais com plantas de algodão Bt, da variedade DP 404 BG (Bollgard), ou sua isolinha não transformada DP 4049. Gaiolas contendo vasos com plantas de algodoeiro Bt e não-Bt foram usadas como arena de escolha, para a avaliação de preferência de adultos alados. O período pré-reprodutivo e reprodutivo, a longevidade, a curva de sobrevivência, a produção de prole total e diária por fêmea e a curva acumulada de produção de prole da população não apresentaram diferenças significativas. Não foi observada diferença na escolha de plantas para colonização por indivíduos alados, o que indica taxas equivalentes de colonização nas populações iniciais. O algodoeiro Bt não afeta a dinâmica populacional de A. gossypii e não aumenta seu potencial de risco como praga.The objective of this work was to develop an experimental protocol to assess the impact of Bt cotton on bionomics and on plant choice for Aphis gossypii colonization. The bionomics of the cotton aphid was assessed in greenhouse with insects reared in individual cages containing Bt cotton plants of the variety DP 404 BG (Bollgard) or its nontransformed isoline DP 4049. Cages with Bt cotton and non-Bt cotton were used as choosing arena for evaluation of winged adults preference. There was no significant difference for pre-reproduction period (immature phase), reproduction period, longevity, survivorship curve total and daily production of offspring by female, and curve of accumulated production of offspring by the population. There was no preference of colonization for any plant by winged adults, which indicates equivalent rates of colonization of the initial populations. Bt cotton plants do not affect the population dynamics of A. gossypii, and do not increase its potential risk as pest

Impacto do algodoeiro Bt na dinâmica populacional do pulgão-do-algodoeiro em casa de vegetação

The objective of this work was to develop an experimental protocol to assess the impact of Bt cotton on bionomics and on plant choice for Aphis gossypii colonization. The bionomics of the cottonaphid was assessed in greenhouse with insects reared in individual cages containing Bt cotton plants of the variety DP 404 BG (Bollgard) or its nontransformed isoline DP 4049. Cages with Bt cotton and non-Bt cottonwere used as choosing arena for evaluation of winged adults preference. There was no signifi cant difference for pre-reproduction period (immature phase), reproduction period, longevity, survivorship curve total and daily production of offspring by female, and curve of accumulated production of offspring by the population.There was no preference of colonization for any plant by winged adults, which indicates equivalent rates of colonization of the initial populations. Bt cotton plants do not affect the population dynamics of A. gossypii,and do not increase its potential risk as pest.O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo experimental para avaliar o impacto do algodoeiro Bt na bionomia e na escolha de plantas para colonização pelo pulgão-do-algodoeiro (Aphisgossypii). A bionomia do pulgão foi avaliada em casa de vegetação com insetos criados em gaiolas individuais com plantas de algodão Bt, da variedade DP 404 BG (Bollgard), ou sua isolinha não transformada DP 4049. Gaiolas contendo vasos com plantas de algodoeiro Bt e não-Bt foram usadas como arena de escolha, para a avaliação de preferência de adultos alados. O período pré-reprodutivo e reprodutivo, a longevidade, a curva de sobrevivência, a produção de prole total e diária por fêmea e a curva acumulada de produção de prole da população não apresentaram diferenças signifi cativas. Não foi observada diferença na escolha de plantas para colonização por indivíduos alados, o que indica taxas equivalentes de colonização nas populações iniciais.O algodoeiro Bt não afeta a dinâmica populacional de A. gossypii e não aumenta seu potencial de risco comopraga

Potenciais receptores de Anthonomus grandis Boheman (coleoptera: curculionidae) para toxinas cry de Bacillus thuringiensis Berliner

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5.The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action

Potenciais receptores de Anthonomus grandis Boheman (coleoptera: curculionidae) para toxinas cry de Bacillus thuringiensis Berliner

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5.The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action

Impacto do algodoeiro Bt na dinâmica populacional do pulgão-do-algodoeiro em casa de vegetação Impact of Bt cotton on the population dynamics of the cotton aphid in greenhouse

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo experimental para avaliar o impacto do algodoeiro Bt na bionomia e na escolha de plantas para colonização pelo pulgão-do-algodoeiro (Aphis gossypii). A bionomia do pulgão foi avaliada em casa de vegetação com insetos criados em gaiolas individuais com plantas de algodão Bt, da variedade DP 404 BG (Bollgard), ou sua isolinha não transformada DP 4049. Gaiolas contendo vasos com plantas de algodoeiro Bt e não-Bt foram usadas como arena de escolha, para a avaliação de preferência de adultos alados. O período pré-reprodutivo e reprodutivo, a longevidade, a curva de sobrevivência, a produção de prole total e diária por fêmea e a curva acumulada de produção de prole da população não apresentaram diferenças significativas. Não foi observada diferença na escolha de plantas para colonização por indivíduos alados, o que indica taxas equivalentes de colonização nas populações iniciais. O algodoeiro Bt não afeta a dinâmica populacional de A. gossypii e não aumenta seu potencial de risco como praga.<br>The objective of this work was to develop an experimental protocol to assess the impact of Bt cotton on bionomics and on plant choice for Aphis gossypii colonization. The bionomics of the cotton aphid was assessed in greenhouse with insects reared in individual cages containing Bt cotton plants of the variety DP 404 BG (Bollgard) or its nontransformed isoline DP 4049. Cages with Bt cotton and non-Bt cotton were used as choosing arena for evaluation of winged adults preference. There was no significant difference for pre-reproduction period (immature phase), reproduction period, longevity, survivorship curve total and daily production of offspring by female, and curve of accumulated production of offspring by the population. There was no preference of colonization for any plant by winged adults, which indicates equivalent rates of colonization of the initial populations. Bt cotton plants do not affect the population dynamics of A. gossypii, and do not increase its potential risk as pest

Ectopic expression of a Meloidogyne incognita dorsal gland protein in tobacco accelerates the formation of the nematode feeding site

International audienceMeloidogyne spp., plant-parasitic nematodes present worldwide, are intensively studied because of the damage caused to a large variety of agronomically important crops. Several reports indicate that proteins from the Meloidogyne spp. dorsal gland might play an important role to allow proper establishment of a functional nematode feeding site. The precise role of these proteins in the process of feeding cell development is unknown. To gain insights into the function of these secreted M. incognita proteins, we constitutively (ectopically) expressed the nematodes dorsal gland protein 7E12 in tobacco plants. It was found that the number of galls at 8 and 16 days after nematode infection was significantly higher in transgenic plants compared to control plants. Eggs from nematodes in transgenic plants hatched faster than those in control plants. Histological analysis of nematode induced galls in transgenic plants clearly shows a different morphology. Giant feeding cells harbor more vacuoles and an increased amount of cell wall invaginations, while neighboring cells surrounding feeding cells are more numerous. These results suggest that the presence of the 7E12 protein in tobacco accelerates gall formation. This assumption is supported by our data illustrating faster gall formation and egg eclosion in transgenic plants. (C) 2010 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved

Biotecnologia: estado da arte e aplicações na agropecuária

730 p., il. colorNeste livro, várias técnicas relacionada a biotecnologia são discutidas por vários especialistas da Embrapa Cerrados e instituições parceiras, sendo um material didático importante para dar uma idéia geral da área, incluindo aspectos conceituais, sua importância histórica e atual e também sua importância futura, considerando toda sua potencialidade e o que ainda vai ser descoberto