Seleção de microorganismos para a conversão de amônio em nitrito e eliminação de nitrogênio de efluentes sintéticos

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2010As implicações econômicas e ambientais do desequilíbrio causado por despejos de efluentes com altas concentrações de nitrogênio em corpos receptores levam à necessidade de soluções eficientes na remoção deste poluente. Neste sentido, novos processos biológicos vêm sendo estudados. Os processos de remoção via nitrito ganham cada vez mais destaque, tendo em vista a redução da demanda de carbono e do suprimento de oxigênio necessários. Um dos fatores limitantes deste tipo de processo é a remoção ou inibição das Bactérias Oxidadoras de Nitrito (BON) enquanto as Bactérias Oxidadoras de Amônia (BOA) permanecem em plena atividade. O objetivo deste trabalho é propor uma forma de seleção dos microrganismos de interesse partindo de uma biomassa heterogênea e, a partir disso, verificar o comportamento desta biomassa na remoção de altas concentrações de nitrogênio amoniacal. O lodo coletado, a cada novo ensaio, na Estação de Tratamento de Esgotos (ETE) do município de Florianópolis-SC, passou por um processo de lavagem em que o reator foi operado de forma continua, sem retenção de células. Altas vazões de alimentação foram aplicadas, utilizando-se meio sintético com cerca de 500 mg N-NH4.L-1. Ao se chegar a uma concentração próxima a 1 g SST.L-1 o reator passou a ser operado como SBR e se seguiam vários ciclos de alimentação. Durante todo período de operação a temperatura, aeração e agitação eram controladas em 35°C, 1VVM e 400 rpm, respectivamente. O pH foi mantido em 7,5 através do controle automático com uma bomba ácido/base. Ao todo foram realizados 9 ensaios, partindo-se de diferentes inóculos e variando algumas estratégias operacionais entre eles. Em um destes ensaios não foi aplicada a lavagem como forma de seleção da biomassa. As maiores velocidades específicas de oxidação de amônio (QNH4) e formação de nitrito (QNO2) foram sempre obtidas no último ciclo de cada ensaio. No ensaio de Agosto/2009, chegaram a 2,33gN-NH4 g-1 SSTd-1 e 1,51gN-NO2 g-1SST d-1 respectivamente. Este comportamento demonstra um fenômeno de adaptação continua da biomassa ao longo de cada ensaio. As medidas de velocidade de consumo de oxigênio confirmaram este fenômeno, já que partiram de valores mínimos, de difícil determinação, nas primeiras horas dos ciclos iniciais e tiveram um acréscimo significativo, chegando a valores superiores a 4 mgO2.g-1SST.min-1. No que diz respeito às porcentagens de remoção de nitrogênio houve uma maior variabilidade e instabilidade. Os valores mais altos ficaram na média dos 30%. Outra observação importante, feita em alguns ensaios, foi que, para valores de QNH4X mais elevados, os valores de QO2X experimentais são inferiores àqueles previstos pela estequiometria do processo, o que pode estar indicando que o amônio não foi todo oxidado a nitrito, evidenciando a ocorrência de uma via metabólica distinta, possivelmente, a desnitrificação aeróbia através do processo NOx. As análises microbiológicas mostraram diferenças entre as populações ao longo de cada ensaio, apresentando uma evolução na presença das BOA em relação aos demais grupos. Os resultados obtidos confirmam o processo de lavagem do lodo como uma alternativa para a seleção de uma biomassa mais específica, dando melhores condições à partida do processo. Além disso a procedência do lodo original revela-se como condição importante para o estabelecimento de um processo eficiente.The economic and environmental implications of the imbalance caused by wastewater discharges with high nitrogen concentration in water-bodies leads to the need of efficient solutions in the removal of this pollutant. New biological processes have been studied. Nitrogen removal via nitrite has been recommended because of its reduces carbon and oxygen demand. One of this process limitations lies in retaining the ammonia oxidizing bacteria (AOB) while eliminating the nitrite oxidizing bacteria (NOB). The objective of this work was to propose a way to enrich the interested microorganisms tarting from a heterogeneous inoculum and verify its removal efficiency of a high ammonium nitrogen concentrations media. The sludge was collected, in each new test, at the municipal Sewage Treatment Station in Florianópolis, SC, and proceeded a washing process in which the reactor was operated continuously, without cells retention. High flow rate was applied, using a synthetic medium with about 500 mg N-NH4.L-1. When it achieved concentration close to 1 g SST.L-1, the reactor began to be operated as SBR and than followed several feeding cycles. During the entire operation period temperature, aeration and stirring were controlled at 35 ° C, 1VVM and 400 rpm, respectively. The pH was maintained at 7.5 by automatic control system with an acid / base pump. Altogether, it were performed 9 tests, starting from different inoculum and varying some operational strategies. In one of these tests it was not applied the wash out procedure as a way of selecting the biomass. The specific ammonium oxidation rate (QNH4) and nitrite formation (QNO2) were always obtained in the last cycle of each test. In August/2009 test, reached 2.33 gN-NH4. g-1TSS.d-1 and 1.51 gN-NO2.g-1TSS.d-1 respectively. This behavior demonstrates a phenomenon of biomass continues adaptation throughout each test. The oxygen consumption rates measurements confirmed this phenomenon, since they departed from minimum values, hard to determine, in the first hours of the initial cycles and had a significant increase, reaching values higher than 4 mgO2.g-1 SST.min-1. The percentage of nitrogen removal had a greater variability and instability. The highest values were about 30%. Another important observation made in some experiments was that for high values of QNH4X, QO2X experimental values were lower than those provided by the process stoichiometry, which may indicate that the ammonium was not all oxidized to nitrite, indicating the occurrence of a distinct pathway, possibly the aerobic denitrification process NOx. Microbiological analysis showed differences among populations throughout each test, showing an evolution in AOB occurrence over the other groups. The results confirm the sludge wash out as an alternative process to select a more specific biomass, giving better conditions to start up a process. Besides, the original sludge source is revealed as an important condition for an efficient process establishment

Isolamento, caracterização e incorporação de fagos polivalentes em esporos bacterianos para uso em controle biológico

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2018.O controle do crescimento microbiano é um desafio crescente nas mais variadas áreas da engenharia, em especial, em sistemas de tratamento de efluentes e em setores produtivos específicos, onde a presença de determinadas bactérias, traz impactos econômico e ambientalmente negativos. Os bacteriófagos vírus que infectam especificamente bactérias e se replicam em seu interior têm sido utilizados como agentes de controle de crescimento microbiano em diversas áreas. Apesar do interesse renovado pela sua aplicação e importância ecológica, fagos com amplo espectro de hospedeiros ainda têm pouca representatividade nos estudos recentes. Além disso, o escopo das aplicações de fagos tem sido limitado por fatores tais como alta especificidade, resistência bacteriana aos fagos e influência de fatores físico-químicos na viabilidade e infectividade dos fagos. O objetivo deste trabalho foi demonstrar que é possível isolar fagos de amplo espectro de hospedeiros e, através da caracterização destes fagos encontrar elementos para compreender sua polivalência. Além disso, explorou-se a incorporação do genoma dos fagos em esporos de Bacillus subtilis, para aumentar a sobrevivência em ambientes desfavoráveis, finalmente, propôs-se uma abordagem diferenciada para o uso de fagos como ferramentas de biocontrole em sistemas de tratamentos de efluentes. Através de uma adaptação da metodologia de isolamento sequencial por múltiplos hospedeiros, isolou-se dois fagos polivalentes, denominados fNA01 e fNA03, capazes de infectar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas com alta eficiência. Os principais parâmetros ligados ao ciclo de vida dos fagos, taxa de adsorção (4,41-18,2×10-10 ml/min para fNA01; 4,13-5,75×10-10 mL/min para fNA03), burst size (100-120 UFP/célula e 90-110 UFP/célula, respectivamente) e período de latência (40 min e 40-50 min, respectivamente), foram determinados para os quatro hospedeiros utilizados no isolamento. Os tipos de receptores bacterianos usados pelo fago fNA01 foram identificados usando células hospedeiras tratadas com periodato ou proteinase, e revelaram ser polissacarídeos para todos os hospedeiros. O fago fNA01 teve seu genoma sequenciado e anotado revelando ser um fago do tipo N4, com um genoma de cerca de 76Kbp e 93ORFs. A análise genômica revelou vários genes com potencial relação com sua ampla gama de hospedeiros, incluindo a presença de três genes codificando RNA polimerase, ao mesmo tempo, forneceu informações sobre suas relações evolutivas com fagos do mesmo gênero infectando uma variedade de bactérias diferentes. Outros dois fagos polivalentes, PBSC1 e PBSC2, após brevemente caracterizados, foram usados para otimizar uma metodologia de incorporação de fagos a esporos de Bacillus subtilis. As condições ótimas para maior eficiência de incorporação dos fagos aos esporos foram encontradas quando os fagos foram introduzidos nos pré-esporos com mais alta taxa de esporulação (10 h de incubação) e MOI 1,0. O tempo de maturação dos esporos de 48 h aumentou tanto o rendimento de esporos quanto a eficiência de incorporação. Comparado com os fagos livres, os fagos protegidos por esporos mostraram uma resistência significativamente maior em relação a altas temperaturas, pH extremo, radiação UVA e presença de íons cobre. Demonstrou-se que a germinação dos esporos pode ser induzida por baixas concentrações de L-alanina ou uma mistura germinativa (L-asparagina, D-glicose, D-frutose e K+) para desencadear a germinação e consequente liberação dos fagos protegidos dentro de 60 a 90 min. Em geral, a resiliência superior de fagos polivalentes protegidos por esporos pode permitir armazenamento dos fagos a longo prazo (não refrigerado) e melhorar a eficiência do tratamento com fagos em condições ambientais adversas. Por fim, propôs-se uma nova abordagem para o uso de fagos no controle microbiano com etapas de isolamento, produção e aplicação que se diferenciam do tratamento convencional.Abstract : Microbial growth control is a challenging issue in many engineering areas, particularly, wastewater treatment systems and in specific productive sectors, where the presence of certain bacteria has economic and environmental negative impacts. Bacteriophages viruses that specifically infect bacteria and replicate inside have been used as microbial control agents in several areas. Despite renewed interest in its application and ecological importance, phages with broad host range still are poorly investigated in recent studies. In addition, the scope of phage applications has been limited by factors such as high specificity, bacterial resistance to phage and physicochemical factors influence on phage viability and infectivity. The aim of this study was to demonstrate that it is possible to isolate broad host range phages and, through the characterization of these phages, to find elements to understand their polyvalence. In addition, we explored phage genome trapping into Bacillus subtilis spores, to increase their survival in harsh environments. Finally, we proposed a new approach for phage application as biocontrol tools in wastewater treatment systems. By adapting the multi-host sequential isolation methodology, two polyvalent phages, fNA01 and fNA03, were isolated, both of them were able of infect Gram-positive and Gram-negative bacteria with high efficiency. The main parameters related to phage life cycle, adsorption rate (4.41-18.2 × 10-10 ml/min for fNA01, 4.13-5.75 × 10-10 ml/min for fNA03), burst size (100-120 PFU/cell and 90-110 PFU/cell, respectively) and latent time (40 min and 40-50 min respectively) were determined for the four isolation hosts. The bacterial receptors molecules used by phage fNA01 were identified using periodate or proteinase treated host cells, and were found to be polysaccharides for all hosts. Phage fNA01 genome was sequenced and annotated revealing this is a N4 like phage, with a genome of about 76Kbp and 93ORFs. Genomic analysis revealed several genes with potential relationship to their wide host range, including the presence of three genes encoding RNA polymerase, at the same time; it provided information on fNA01 evolutionary relationships with phages of the same genus infecting a variety of different bacteria. Two other polyvalent phages, PBSC1 and PBSC2, after being briefly characterized, were used to optimize a phage incorporation into Bacillus subtilis spores methodology. The optimal conditions for greater efficiency of phages incorporation into the spores were found when the phages were introduced into the pre-spores with the highest sporulation rates (10 h incubation) and MOI 1.0. The spores maturation time of 48 h increased both spore yield and incorporation efficiency. Compared with free phages, spore-protected phages showed significantly higher resistance to high temperatures, extreme pH, UVA radiation and the presence of copper ions. It was showed that spore germination may be induced by low concentrations of L-alanine or a germinant mix (L-asparagine, D-glucose, D-fructose and K+) to trigger germination and release protected phages within 60 to 90 min. In general, polyvalent phage trapped in spores superior resilience can allow long-term (non-refrigerated) phage storage and improve the efficiency of phage treatment under adverse environmental conditions. Finally, a new approach was proposed for the use of phages in microbial control with isolation, production and application steps that differ from conventional treatment

Sobrevivência de coliformes em sistema anaeróbico para o tratamento de dejetos suínos

25