Estudio químico de porfirinas excretadas por orina en estados de porfiria

Las porfirinas son pigmentos tetrapirrólicos, precursoresnormales en el camino biosintético que conduce a Protoporfirina IX, Clorofila, Catalasa, etc., que se excretan por orina y hecesen cantidades anormalmente elevadas en estados patológicosdenominados porfirias. Existen diversos tipos de ellas y se las clasifica deacuerdo a su distinta sintomatología clinica, existiendo un cuadroquímico particular asociado a cada tipo de porfiria. Los casos estudiados en la presente investigación pertenecíantodos al tipo más frecuente en nuestro país: Porfiria hepática.tipo cutánea tarda. Se caracterizan por presentar fotosensibilidad,apareciendo aritemas en las partes expuestas a laluz y, posteriormente, necrosis. Generalmente está asociada a a1gúntipo de disfunción hepática y aparece en la edad adulta. La orina de estos enfermos es de un color oscuro, emiteintensa fluorescencia roja a la luz UV y, espectrocópicamente.se observan bandas de absorción caracteristicas de complejos metálicos de porfirinas. En el momentode comenzar la investigación. existían diversosinterrogantes sobre la composición quimica del complejo porfirínicoexcretado por orina en estos casos; a saber : a) La composición cuali-cuantitativa del mismo. b) La composición de la llamada Porfirina de Waldenstrom. Esta es una sustancia extraible de la orina de pacientes porfiricos,llevada a pH 3.0-3.2. por acetato de etilo, la que, segúninvestigadores del grupo de Watson, está constituida fundamentalmentepor Uro I, con pequeñas cantidades de otra porfirina a la quedenominaban Porfirina 208 ó Firiaporfirina. En cambio, para los del grupo de Rimington. el principalcomponente de la Porfirina de Waldenstrom es Uro III. c) La composición de la fracción Uroporfirina que se obteníade orinas porfíricas. d) La estructura isomérica de la Firiaporfirina (porfirinade 7 carboxilos). e) La naturaleza de dos porfirinas que se aislaban delas mismas orinas y que tenian en su estructura sólo 5 y 6 carboxilos. f) La estructura isomérica de la fracción Coproporfirinas,también provenientes de orinas de porfirias hepáticas. Además, por disponer de orinas de ratas a las que sehabía intoxicado por la administración diaria de hexaclorobencenodurante 6 meses. las que comenzarona excretar cantidades apreciablesde porfirinas por orina a partir del tercer mes de comenzara drogarlas, se estudió también la composición cuali-cuantitativadel total de porfirinas urinarias. Para llevar a cabo los estudios necesarios para aclararestos puntos en cuestión, se procedió primero a extraer las porfirinasde las orinas, llevando las mismas a pH 3.0-3.2 (puntoisoeléctrico de las porfirinas) y adsorbiéndolas luego con talcoo bien extrayendolas con acetato de etilo. Posteriormente, se las esterificaba con una mezcla demetanol - SO4H2(19:1) durante 24-48 horas y luego se las pasabaa cloroformo. Las soluciones clorofórmicas se analizaron por cromatografíaen columnas de carbonato de calcio, usando como solventede desarrollo una mezcla de benceno-cloroformo (4:l) y por cromatografíasobre papel según el método de Falk y Benson, estudiandolasademás cuantitativamente por medio de una variante de estatécnica para microcantidades desarrollada por Batlle y Grinstoin. También se las cristalizaba, observando su forma cristalinaal microscopio y determinando los micropuntos de fusión;asimismo, se procedió a descarboxilarlas por el método de Edmonsony Schwartz, estudiando luego los productos de descarhoxilacióny determinando la estructura isomérica de la porfirina originalmediante la observación de la Coproporfirina obtenida. Para determinar el tipo isomérico de la Coproporfirina,se la cristalizaba, observaba al microscopio, determinaha su P.F.y se la sometia a una cromatografía sobre papel, según el métodode Eriksen para porfirinas libres, que permite distinguir los isómeros I y III de la Copro. Además, se determinaron espectrofotométricamente las máximosy espectros de absorción de las porfirinas obtenidas. Las experiencias realizadas y los resultados obtenidosse pueden esquematizar de la siáuiente manera: A) Cromatografía de los extractos totales de porfirinas de orina: La mezcla total de porfirinas obtenidas de las orinaspor adsorción con talco y esterificación, se cromatografió en columnasde carbonato de calcio, obteniéndose cromatogramas de 8bandas, de las que las 5 inferiores correspondían respectivamentea Uro, Firia, Hexa, Penta y Copro, como se comprobó cromatografiandocada fracción sobre papel. Se efectuó también una cromatografía cuantitativa sobrepapel de las porfirinas obtenidas de dichas bandas, la que dió valorescoincidentes en los 4 casos investigados. Los resultados obtenidosfueron aproximadamente: Uro I: 40%; Uro III: 10%; Firia: 15%; Hexa: 5%; renta: 8% y Copro: 22%i B) Composición de la Porfirina de Waldenstron: La porfirina de Waldenstrom extraída de orina según elmétodo original indicado por este autor, fué cromatografiada encolumna, obteniéndose fundamentalmente una banda de Uro y otrade Firia. La cromatografía sobre papel de la primera de ellas, indicóque estaba constituida por una mezcla de Uro I y Uro III. Otra muestra de PW se trató por extracción con acetatode etilo. obteniéndose una fracción insoluble, compuesta por Uro I y una pequeña cantidad de una porfirina soluble, la que estabaformada por Uro III y Firia. La cromatografía cuantitativas sobre papel de la P.W.dió como resultados: Uro I: 65%; Uro III: 15% y Firia: 20% aproxinadamrate. La descarboxilación de esta porfirina dió fundamentalmente Copro I, con una pequeña cantidad de Copro III. C) Composición de la Uroporfirina de orinas porfiricas: Una fracción Uro obtenida por cromatografía en columnade un extracto total de porfirinas de orina, se cromatografió lentamente para obtener una banda ancha y difusa, se cortó la mismaen dos partes y se analizó por cromatografía en papel para versi existia diferencias entre ellas. La inferior tenia menos Uro III. Tambiénse trató de separar Uro I y Uro III por cristalizaciónfraccionada. Se logró obtener Uro III. con algo de Firia,pero libre de Uro I. También se analizó por el método cuantitativo de cromatografíasobre papel. hallando que estaba formada por una mezclade Uro I y Uro III en 1a proporción de 4:1. D) Estudio de la Firiaporfirina: Se la aisló por cromatografía en columna de carbonatode calcio de las porfirinas totales de orina y se la cristalizó,identificó según los métodos habituales y, posteriormente, descarboxiló,obteniéndose únicamente Copro III. Por lo tanto, seconcluyó que se trata de Firia III. E) Estudio de la Hexa y Pentaporfirina: Se las aisló por el mismo procedimiento anterior y analizóde igual manera. En el caso de la Hexa, por descarboxilaciónse obtuvo sólo Copro III, por lo que se le identificó como Hexa III. En cambio, en el descarboxilado de Penta se halló una mezcla de Copro I y III; en consecuencia la fracción Penta debia de sertambién mezcla de isómeros I y III. Asimismo, se determinaron espectrofotométricamente losespectros de absorción. F) Identificación de las Coproporfirinas: Siguiendo el mismo procedimiento de aislación anteriormentedescripto y cromatografiando la Copro obtenida por el métodode Eriksen sobre papel, se comprobó que era una mezcla de isómeros Iy III. G)Investigación cuali-cuantitativa de porfirinas de orinas de ratas: Las porfirinas extraídas por adsorción con talco de orinasde ratas intoxicadas por hexaclorobenceno, se cromatogrsfiaron encolumna de carbonato de calcio y cuali- y cuantitativamente sobrepapel, obteniendo resultados similares a los hallados en los casosde porfiria humana. En base a los resultados obtenidos en los estudios de porfiriashumanas, se sugiere que, en lo que se refiere a las porfirinasde tipo isomérico III, la acumulación de Copro provocaría laaparición de Penta III y Hexa III, probablemente por un mecanismode regulación enzimática tipo "feed back"; en cambio la acumulaciónde Firia III se explicaría por inhibición del sistema enzimáticoresponsable de su descarboxilación, hallándose Uro III también debidoa un mecanismo "feed back". En cuanto a las porfirinas de la serie I, al hallarse grancantidad de Uro I, apreciable cantidad de Copro I y poca Penta I, sepiensa que la acumulación de Uro I que se encuentra. puede ser debidaa poca actividad del sistema enzimático descarboxilento paraesta porfirina, siendo ésto el paso limitante de la velocidad en estaserie isomérica. En cuanto a la Copro I, se acumularia por serel producto final del metabolismo de porfirinas de tipo I, apareciendoalgo de Penta I, también aquí, como consecuencia de un “feedback". Es de interés la semejanza entre el cuadro químico de lasporfirinas de orinas de ratas y las extraídas de casos humanos, dadoque, de confirmarse ésta en posteriores estudios, indicaria la posibilidadde producir experimentalmente porfirias hepaticas deltipo cutánea tarda.Fil: Nacht, Sergio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

The In Vitro Permeability Of Skin And Buccal Mucosa To Selected Drugs And Tritiated Water

The permeability of whole human skin, human dermis, whole pig skin, and canine buccal mucosa have been determined for four chemically different solutes: tritiated water, amphetamine, estradiol, and ouabain. Several new in vitro techniques for isolation, preservation, and permeability determination of these membranous tissues are described. Water permeabilities of human epidermis and dermis using these techniques agree well with published results. Human and porcine skins are very similar with respect to water permeability, while buccal mucosa is similar to dermis in its permeability characteristics to the four representative test agents. The permeability of hydrated whole skin is determined by the permeability of the epidermis, and the dermis and buccal mucosa behave as if they are water barriers exhibiting a permeability of about 30% of the diffusion through pure water, a difference that can be ascribed to the porosity and/or tortuosity of the tissue matrix

A Method for Measuring Desquamation and its Use for Assessing the Effects of Some Common Exfoliants

Desquamation has been measured in the past by a counting chamber technique after corneocytes are removed from the skin surface and disaggregated in a dilute surfactant solution. However, we have found that complete corneocyte disaggregation is not always possible when these aggregates are recovered from sites where patent peeling is induced. Corneocyte counting in such instances is difficult or impossible. We have devised a method of measuring desquamation wherein the desquamating cells are determined as the total alkali-soluble protein after they are removed from the skin surface with an inert, self-hardening gel. Highly reproducible desquamation rates are obtained, characteristic of the individual subject. Using some common exfoliants, we show that pharmacologic response, observed as an increase in desquamation rate, is also an individual characteristic

Estudio químico de porfirinas excretadas por orina en estados de porfiria

Las porfirinas son pigmentos tetrapirrólicos, precursoresnormales en el camino biosintético que conduce a Protoporfirina IX, Clorofila, Catalasa, etc., que se excretan por orina y hecesen cantidades anormalmente elevadas en estados patológicosdenominados porfirias. Existen diversos tipos de ellas y se las clasifica deacuerdo a su distinta sintomatología clinica, existiendo un cuadroquímico particular asociado a cada tipo de porfiria. Los casos estudiados en la presente investigación pertenecíantodos al tipo más frecuente en nuestro país: Porfiria hepática.tipo cutánea tarda. Se caracterizan por presentar fotosensibilidad,apareciendo aritemas en las partes expuestas a laluz y, posteriormente, necrosis. Generalmente está asociada a a1gúntipo de disfunción hepática y aparece en la edad adulta. La orina de estos enfermos es de un color oscuro, emiteintensa fluorescencia roja a la luz UV y, espectrocópicamente.se observan bandas de absorción caracteristicas de complejos metálicos de porfirinas. En el momentode comenzar la investigación. existían diversosinterrogantes sobre la composición quimica del complejo porfirínicoexcretado por orina en estos casos; a saber : a) La composición cuali-cuantitativa del mismo. b) La composición de la llamada Porfirina de Waldenstrom. Esta es una sustancia extraible de la orina de pacientes porfiricos,llevada a pH 3.0-3.2. por acetato de etilo, la que, segúninvestigadores del grupo de Watson, está constituida fundamentalmentepor Uro I, con pequeñas cantidades de otra porfirina a la quedenominaban Porfirina 208 ó Firiaporfirina. En cambio, para los del grupo de Rimington. el principalcomponente de la Porfirina de Waldenstrom es Uro III. c) La composición de la fracción Uroporfirina que se obteníade orinas porfíricas. d) La estructura isomérica de la Firiaporfirina (porfirinade 7 carboxilos). e) La naturaleza de dos porfirinas que se aislaban delas mismas orinas y que tenian en su estructura sólo 5 y 6 carboxilos. f) La estructura isomérica de la fracción Coproporfirinas,también provenientes de orinas de porfirias hepáticas. Además, por disponer de orinas de ratas a las que sehabía intoxicado por la administración diaria de hexaclorobencenodurante 6 meses. las que comenzarona excretar cantidades apreciablesde porfirinas por orina a partir del tercer mes de comenzara drogarlas, se estudió también la composición cuali-cuantitativadel total de porfirinas urinarias. Para llevar a cabo los estudios necesarios para aclararestos puntos en cuestión, se procedió primero a extraer las porfirinasde las orinas, llevando las mismas a pH 3.0-3.2 (puntoisoeléctrico de las porfirinas) y adsorbiéndolas luego con talcoo bien extrayendolas con acetato de etilo. Posteriormente, se las esterificaba con una mezcla demetanol - SO4H2(19:1) durante 24-48 horas y luego se las pasabaa cloroformo. Las soluciones clorofórmicas se analizaron por cromatografíaen columnas de carbonato de calcio, usando como solventede desarrollo una mezcla de benceno-cloroformo (4:l) y por cromatografíasobre papel según el método de Falk y Benson, estudiandolasademás cuantitativamente por medio de una variante de estatécnica para microcantidades desarrollada por Batlle y Grinstoin. También se las cristalizaba, observando su forma cristalinaal microscopio y determinando los micropuntos de fusión;asimismo, se procedió a descarboxilarlas por el método de Edmonsony Schwartz, estudiando luego los productos de descarhoxilacióny determinando la estructura isomérica de la porfirina originalmediante la observación de la Coproporfirina obtenida. Para determinar el tipo isomérico de la Coproporfirina,se la cristalizaba, observaba al microscopio, determinaha su P.F.y se la sometia a una cromatografía sobre papel, según el métodode Eriksen para porfirinas libres, que permite distinguir los isómeros I y III de la Copro. Además, se determinaron espectrofotométricamente las máximosy espectros de absorción de las porfirinas obtenidas. Las experiencias realizadas y los resultados obtenidosse pueden esquematizar de la siáuiente manera: A) Cromatografía de los extractos totales de porfirinas de orina: La mezcla total de porfirinas obtenidas de las orinaspor adsorción con talco y esterificación, se cromatografió en columnasde carbonato de calcio, obteniéndose cromatogramas de 8bandas, de las que las 5 inferiores correspondían respectivamentea Uro, Firia, Hexa, Penta y Copro, como se comprobó cromatografiandocada fracción sobre papel. Se efectuó también una cromatografía cuantitativa sobrepapel de las porfirinas obtenidas de dichas bandas, la que dió valorescoincidentes en los 4 casos investigados. Los resultados obtenidosfueron aproximadamente: Uro I: 40%; Uro III: 10%; Firia: 15%; Hexa: 5%; renta: 8% y Copro: 22%i B) Composición de la Porfirina de Waldenstron: La porfirina de Waldenstrom extraída de orina según elmétodo original indicado por este autor, fué cromatografiada encolumna, obteniéndose fundamentalmente una banda de Uro y otrade Firia. La cromatografía sobre papel de la primera de ellas, indicóque estaba constituida por una mezcla de Uro I y Uro III. Otra muestra de PW se trató por extracción con acetatode etilo. obteniéndose una fracción insoluble, compuesta por Uro I y una pequeña cantidad de una porfirina soluble, la que estabaformada por Uro III y Firia. La cromatografía cuantitativas sobre papel de la P.W.dió como resultados: Uro I: 65%; Uro III: 15% y Firia: 20% aproxinadamrate. La descarboxilación de esta porfirina dió fundamentalmente Copro I, con una pequeña cantidad de Copro III. C) Composición de la Uroporfirina de orinas porfiricas: Una fracción Uro obtenida por cromatografía en columnade un extracto total de porfirinas de orina, se cromatografió lentamente para obtener una banda ancha y difusa, se cortó la mismaen dos partes y se analizó por cromatografía en papel para versi existia diferencias entre ellas. La inferior tenia menos Uro III. Tambiénse trató de separar Uro I y Uro III por cristalizaciónfraccionada. Se logró obtener Uro III. con algo de Firia,pero libre de Uro I. También se analizó por el método cuantitativo de cromatografíasobre papel. hallando que estaba formada por una mezclade Uro I y Uro III en 1a proporción de 4:1. D) Estudio de la Firiaporfirina: Se la aisló por cromatografía en columna de carbonatode calcio de las porfirinas totales de orina y se la cristalizó,identificó según los métodos habituales y, posteriormente, descarboxiló,obteniéndose únicamente Copro III. Por lo tanto, seconcluyó que se trata de Firia III. E) Estudio de la Hexa y Pentaporfirina: Se las aisló por el mismo procedimiento anterior y analizóde igual manera. En el caso de la Hexa, por descarboxilaciónse obtuvo sólo Copro III, por lo que se le identificó como Hexa III. En cambio, en el descarboxilado de Penta se halló una mezcla de Copro I y III; en consecuencia la fracción Penta debia de sertambién mezcla de isómeros I y III. Asimismo, se determinaron espectrofotométricamente losespectros de absorción. F) Identificación de las Coproporfirinas: Siguiendo el mismo procedimiento de aislación anteriormentedescripto y cromatografiando la Copro obtenida por el métodode Eriksen sobre papel, se comprobó que era una mezcla de isómeros Iy III. G)Investigación cuali-cuantitativa de porfirinas de orinas de ratas: Las porfirinas extraídas por adsorción con talco de orinasde ratas intoxicadas por hexaclorobenceno, se cromatogrsfiaron encolumna de carbonato de calcio y cuali- y cuantitativamente sobrepapel, obteniendo resultados similares a los hallados en los casosde porfiria humana. En base a los resultados obtenidos en los estudios de porfiriashumanas, se sugiere que, en lo que se refiere a las porfirinasde tipo isomérico III, la acumulación de Copro provocaría laaparición de Penta III y Hexa III, probablemente por un mecanismode regulación enzimática tipo "feed back"; en cambio la acumulaciónde Firia III se explicaría por inhibición del sistema enzimáticoresponsable de su descarboxilación, hallándose Uro III también debidoa un mecanismo "feed back". En cuanto a las porfirinas de la serie I, al hallarse grancantidad de Uro I, apreciable cantidad de Copro I y poca Penta I, sepiensa que la acumulación de Uro I que se encuentra. puede ser debidaa poca actividad del sistema enzimático descarboxilento paraesta porfirina, siendo ésto el paso limitante de la velocidad en estaserie isomérica. En cuanto a la Copro I, se acumularia por serel producto final del metabolismo de porfirinas de tipo I, apareciendoalgo de Penta I, también aquí, como consecuencia de un “feedback". Es de interés la semejanza entre el cuadro químico de lasporfirinas de orinas de ratas y las extraídas de casos humanos, dadoque, de confirmarse ésta en posteriores estudios, indicaria la posibilidadde producir experimentalmente porfirias hepaticas deltipo cutánea tarda.Fil: Nacht, Sergio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina