Caracterización del rol de la proteína de unión a ARN TbRRM1 de Trypanosoma brucei

Dado que la transcripción en Tripanosomátidos es policistrónica, la regulación de la expresión génica en estos organismos se da principalmente a nivel post-transcripcional mediante proteínas de unión a ARN. Nuestra proteína de estudio, TbRRM1, presenta tres dominios RRM de unión a ARN y forma parte del grupo de proteínas SR-relacionadas. Previamente, se ha demostrado en nuestro laboratorio que TbRRM1 es esencial para la sobrevida en el estadio procíclico de Trypanosoma brucei ya que su silenciamiento por ARNi afecta la curva de crecimiento y produce morfologías aberrantes. En este trabajo, se propuso caracterizar a la proteína de unión a ARN TbRRM1 y estudiarla como posible blanco terapéutico para el tratamiento de las Tripanosomiasis. Para ello, se generó un sistema estable para el silenciamiento inducible de TbRRM1 en el estadio sanguíneo de T. brucei. Los resultados demostraron que, al igual que en el estadio procíclico, TbRRM1 resultaesencial en el estadio del mamífero ya que su silenciamiento produce unadisminución en la curva de crecimiento. Además, se demostró que la muerte de los parásitos se produce por un mecanismo compatible con apoptosis en ambos estadios de T. brucei. Los estudios de la cuantificación de núcleos y kinetoplastos en ambos estadios junto con el análisis del ciclo celular por marcación con ioduro de propidio y citometría de flujo demostraron queTbRRM1 es necesaria para la progresión normal del ciclo celular. Además, el silenciamiento de TbRRM1 en el estadio sanguíneo produjo la aparición de parásitos con flagelo desprendido y de células conectadas por su extremo posterior, lo que indica que TbRRM1 es necesaria para la correcta citoquinesis. Por otra parte, se evaluaron los efectos de la sobreexpresión de TbRRM1 en el estadio procíclico y se determinó que la elevada sobreexpresión de la proteína produce un fenotipo letal similar al observado luego del silenciamiento de TbRRM1.Mediante los ensayos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral, se caracterizó a la proteína de unión a ARN TbRRM1 demostrando que es esencial para la sobrevida en ambos estadios de T. brucei. Además, dado que TbRRM1 es esencial para el parásito y que no posee ortólogos en humanos, puede ser considerada un blanco potencial para el desarrollo de drogas que permitan mejorar la calidad de vida de pacientes que padecen enfermedades causadas por TripanosomátidosSince transcription in Trypanosomatids is polycistronic, regulation of gene expression in these organisms occurs mainly at post-transcriptional level by RNA binding proteins. Our protein of interest, TbRRM1 has three RRM RNA binding domains and is a member of the group of SR-related proteins. Previously, it has been shown in our laboratory that TbRRM1 is essential for survival in the procyclic form stage of Trypanosoma brucei since its silencing by RNAi affects the growth curve and produces aberrant phenotypes. This study aimed to characterize the TbRRM1 RNA binding protein and study it as a possible therapeutic target for the treatment of Trypanosomiasis. For this purpose, a stable system was generated for the inducible silencing of TbRRM1 in the bloodstream form stage. The results showed that, as in the procyclic stage, TbRRM1 is essential for the mammalian stage since its silencing produces a decrease in the growth curve. In addition, it was demonstrated that the parasite death occurs by a mechanism compatible with apoptosis in both stages of T. brucei. The quantification of nuclei and kinetoplasts in both stages together with the analysis of the cell cycle by propidium iodide and flow cytometry showed that TbRRM1 is necessary for the normal progression of the cell cycle. In addition, silencing of TbRRM1 in the bloodstream form stage of T. brucei produced the appearance of parasites with flagellum detachment and cells connected by their posterior end, indicating that TbRRM1 is necessary for cytokinesis. On the other hand, the effects of overexpression of TbRRM1 in the procyclic stage were evaluated and it was determined that the high overexpression of the protein produces a lethal phenotype similar to that observed after the silencing of TbRRM1. Through the research carried out in this Thesis, TbRRM1 RNA binding protein was characterized, having demonstrated that it is essential for survival in both stages of T. brucei. Moreover, given that TbRRM1 is essential for the parasite and that it does not have orthologs in humans, it can be considered a potential target for the development of drugs that improve the quality of life of patients suffering from diseases caused by Trypanosomatids.Fil: Níttolo, Analía Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentin

Depletion of the SR-related protein TbRRM1 leads to cell cycle arrest and apoptosis-like death in Trypanosoma brucei

Arginine-Serine (RS) domain-containing proteins are RNA binding proteins with multiple functions in RNA metabolism. In mammalian cells this group of proteins is also implicated in regulation and coordination of cell cycle and apoptosis. In trypanosomes, an early branching group within the eukaryotic lineage, this group of proteins is represented by 3 members, two of them are SR proteins and have been recently shown to be involved in rRNA processing as well as in pre-mRNA splicing and stability. Here we report our findings on the 3rd member, the SR-related protein TbRRM1. In the present study, we showed that TbRRM1 ablation by RNA-interference in T. brucei procyclic cells leads to cell-cycle block, abnormal cell elongation compatible with the nozzle phenotype and cell death by an apoptosis-like mechanism. Our results expand the role of the trypanosomal RS-domain containing proteins in key cellular processes such as cell cycle and apoptosis-like death, roles also carried out by the mammalian SR proteins, and thus suggesting a conserved function in this phylogenetically conserved protein family.Fil: Levy, Gabriela Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Bañuelos, Carolina Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Níttolo, Analía Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Ortiz, Gastón Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Mendiondo, Nicolas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Moretti, Georgina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Tekiel, Valeria Sonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Sanchez, Daniel Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentin

The Trypanosoma brucei RNA-Binding protein TbRRM1 is involved in the transcription of a subset of RNA Pol II-Dependent genes

It has been long thought that RNA Polymerase (Pol) II transcriptional regulation does not operate in trypanosomes. However, recent reports have suggested that these organisms could regulate RNA Pol II transcription by epigenetic mechanisms. In this paper, we investigated the role of TbRRM1 in transcriptional regulation of RNA Pol II-dependent genes by focusing both in genes located in a particular polycistronic transcription unit (PTU) and in the monocistronic units of the SL-RNA genes. We showed that TbRRM1 is recruited throughout the PTU, with a higher presence on genes than intergenic regions. However, its depletion leads both to the decrease of nascent RNA and to chromatin compaction only of regions located distal to the main transcription start site. These findings suggest that TbRRM1 facilitates the RNA Pol II transcriptional elongation step by collaborating to maintain an open chromatin state in particular regions of the genome. Interestingly, the SL-RNA genes do not recruit TbRRM1 and, after TbRRM1 knockdown, nascent SL-RNAs accumulate while the chromatin state of these regions remains unchanged. Although it was previously suggested that TbRRM1 could regulate RNA Pol II-driven genes, we provide here the first experimental evidence which involves TbRRM1 to transcriptional regulation.Fil: Bañuelos, Carolina Paula. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Levy, Gabriela Vanesa. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Níttolo, Analía Gabriela. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Roser, Leandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Tekiel, Valeria Sonia. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Sanchez, Daniel Oscar. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentin

TbRRM1 knockdown produces abnormal cell morphology and apoptotic-like death in the bloodstream form of T. brucei

TbRRM1, an SR-related protein, is involved in transcriptional and post-transcriptional gene expression regulation in procyclic T. brucei. In previous work, we found that TbRRM1 is essential and its depletion leads to cell cycle impairment, aberrant phenotypes and cell loss by apoptotic-like death. Here, we report the findings obtained after TbRRM1 knockdown in bloodstream parasites. Depletion of TbRRM1 in this cell stage led also to growth arrest and cell loss by apoptosis-like death. However, microscopic analysis showed aberrant cell morphology with parasites displaying flagellum detachment and cytokinesis impairment after RNAi induction, suggesting that TbRRM1 could play different roles depending on parasite stage.Fil: Níttolo, Analía Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Bañuelos, Carolina Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Saborit, Juan I.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Tekiel, Valeria Sonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Sanchez, Daniel Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Levy, Gabriela Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentin

TbRRM1 is essential for parasite survival.

<p><b>(A)</b> Cumulative growth of TbRRM1 RNAi trypanosomes in the absence (TET-) or presence (TET+) of tetracycline for the indicated times. Error bars indicate the standard deviations around the means of three independent experiments. <b>(B)</b> Northern blot analysis of TbRRM1 mRNA after silencing. A 28S rRNA probe was used as loading control. <b>(C)</b> Western blot analysis of TbRRM1 over time following induction of TbRRM1 RNAi in both 5´UTR and ORF cell lines. Either anti-transaldolase (TAL) or anti-enolase (Enol) serum was used as loading control. <b>(D)</b> Immunofluorescence of TbRRM1 in un-induced cultures or 48 h after TET addition. From left to right: phase contrast, DAPI stained cells, anti-TbRRM1 stained cells and merged images. Note the nozzle phenotype in TET+ cells.</p

TbRRM1 silencing induced aberrant nucleus-kinetoplast (N-K) configurations and abnormal phenotypes.

<p><b>(A)</b> Distribution of normal and aberrant phenotypes (nozzle, lollipop, zoid and indeterminate cells) after RNAi induction. <b>(B)</b> N-K configuration graphics showing the percentage of cells presenting xNxK arrangement at different time points after RNAi induction. Inset: Percentage of N-K configuration of the nozzled cells from 24 h to 72 h after TET addition. For reference, 1N1K* indicates cells with one nucleus—one elongated kinetoplast; 2N2K# represents parasites with abnormal N-K distribution. Results were obtained from more than 200 cells at each time point of three independent experiments. Data was analyzed by Student t test compared to 24 h TET- values. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.</p

TbRRM1 is involved in the regulation of TbNOP86.

<p>Change in mRNA abundance after 24 h of TbRRM1 RNAi induction assayed by RTqPCR. Values are expressed as mRNA relative abundance from TET+ / TET- assays. Data were obtained from at least three independent experiments.</p

TbRRM1 depletion induced impairment of DNA synthesis.

<p><b>(A)</b> BrdU incorporation assay over time obtained by immunofluorescence (IIF, circles) or FACS (triangles). DNA synthesis impairment was determined by the TET+/TET- ratio, calculated as the percentage of BrdU-positive cells from both 24 h and 48 h TET+ cultures relative to the percentage of BrdU-positive cells from 24 h and 48 h TET- cultures, respectively, multiplied by 100. Error bars indicate the standard deviations around the means of the TET+/TET- ratio from either four independent experiments for FACS assay or three for IIF. <b>(B)</b> FACS histograms of un-induced or TET+ treated parasites labeled with BrdU (FL-1). Histograms representative of quadruplicate experiments are shown. <b>(C)</b> Graphic showing the index of variation (IV) obtained by the equation (TM-CM)/CM, where TM is the mean of FL-1 fluorescence for TET+ parasites and CM is that of the non-treated cells. Horizontal line shows the IV mean for the biological replicates. The table indicates the number of BrdU positive cells analyzed in each independent experiment.</p

TbRRM1 deficient cells exhibited a nozzle phenotype.

<p><b>(A)</b> Upper: Graphic bars showing the length from nucleus to kinetoplast (N-K; gray bars) or from kinetoplast to posterior end (K-P; black bars) at 0, 24, 48 and 72 h post RNAi induction. Results are expressed as mean ± standard deviation from more than 200 cells at each time point of three independent experiments (Student t test. *p<0,05; **p<0,01). Bottom: DAPI stained PC. <b>(B)</b> Cytoskeleton analysis of 48 h <i>TbRRM1</i> silenced cells by immunofluorescence (anti-tyrosinated tubulin YL1/2). From left to right: phase contrast, DAPI stained cells, YL1/2 stained cells and merged images. Scale bar: 3 μm.</p