Maîtrise de la fermentation butyrique par la microflore lactique réductrice

One of the main specie leading to late blowing defect in hard and semi-hard cheese amongst Clostridia is C. tyrobutyricum. There are various preventives methods to control or prevent spores contamination from C. tyrobutyricum such as Good Dairy Farming Practice, Clostridium spore counting in milk before cheese making or even adding food additives, the use of bactofugation or microfiltration. However, only a low concentration leads to the late blowing defect. The results of Food-Redox shown that modulating the cheese redox environment by reducing lactic bacteria could have an impact on the occurrence of the late blowing defect. The aim of this Ph.D work was to study the impact of Eh on C. tyrobutyricum germination and metabolism.Therefore, we selected various lactic bacteria strains according to their reducing activity with various exiting methods. In the meantime, we developed a new microplate screening method to discriminate lactic bacteria from a same specie based on their reducing activity through a specific liquid medium supplemented with tetrazolium salt. This selection let us obtain different reduction profile from lactic acid bacteria cultures composed of one or more species.We added these reducing lactic bacteria to Emmental cheesemaking contaminated with C. tyrobutyricum spores in order to determine the impact of their reducing activity on C. tyrobutyricum. It appears that the combination of a Lactococcus and a Lactobacillus, both of which are highly reducing, could delay the onset of the late blowing defect caused by C. tyrobutyricum.We worked with the C. tyrobutyricum CIRM BIA 2237 strain known to be able to induce late blowing defect in Emmental cheeses. Sequencing genome and bioinformatic analyses have led us to propose a new metabolic scheme with lactate and acetate as the only carbon sources. The analysis of the metabolic flows of the butyric fermentation from C. tyrobutyricum allowed to validate this new scheme from metabolites data at steady-state of continuous fermentation.However, the study of metabolic flux analysis from C. tyrobutyricum butyric acid fermentation at different Eh conditions did not really show any impact. On the contrary, the application of different Eh conditions made it possible to demonstrate a delay in the initiation of germination in a reducing environment, which could explain the results obtained in cheesemaking.Parmi les Clostridia, C. tyrobutyricum est l’espèce majeure à l’origine du défaut de gonflement tardif retrouvé chez les fromages à pâte pressée. Il existe différentes méthodes de contrôle ou préventives pour réduire la population de spores de C. tyrobutyricum comme « les bonnes pratiques laitières », un dénombrement des spores de Clostridium dans le lait avant fabrication fromagère ou encore l’ajout d’additifs, l’utilisation de la bactofugation ou de la microfiltration. Cependant, il suffit d’une très faible concentration de spores pour voir apparaître ce défaut. Les résultats du projet Food-Redox ont montré que la modulation de l'environnement redox par des bactéries lactiques réductrices pourrait avoir un impact sur l’apparition du gonflement tardif dans les fromages. L’objectif de cette thèse a été d’étudier l’impact du Eh sur la germination, la croissance et le métabolisme de C. tyrobutyricum.Pour cela, nous avons sélectionné différentes souches de bactéries lactiques en fonction de leur activité réductrice à l’aide de différentes méthodes déjà existantes. En parallèle, nous avons développé une nouvelle méthode de criblage en plaque 96 puits, permettant de discriminer des bactéries lactiques d’une même espèce en fonction de leur activité réductrice via un milieu spécifique supplémenté avec un sel de tétrazolium. Cette méthode a permis de sélectionner des souches de bactéries lactiques selon leur profil de réduction, en culture pure ou en culture mixte.Nous avons utilisé ces différentes bactéries lactiques réductrices dans des fabrications type Emmental contaminées avec des spores de C. tyrobutyricum afin de déterminer l’impact de leur activité réductrice sur le défaut de gonflement tardif. Il s’est avéré que la combinaison d’un lactocoque et d’un lactobacille hétérofermentaire facultatif, tous deux fortement réducteurs, pourrait permettre de retarder l’apparition de l’accident.Nous avons travaillé avec la souche C. tyrobutyricum CIRM BIA 2237 connue pour être capable d’engendrer le gonflement tardif dans les fromages type Emmental. Un séquençage de son génome et des analyses bio-informatiques ont permis de proposer un nouveau schéma métabolique avec le lactate et l’acétate comme seules sources de carbone. L’analyse des flux métaboliques de la fermentation butyrique chez C. tyrobutyricum a permis de valider ce nouveau schéma à partir des métabolites quantifiés à l’état stationnaire d’une fermentation continue. En revanche, l’étude des flux métaboliques de C. tyrobutyricum, à différentes conditions de Eh, n’a pas montré de réel impact de ce paramètre. Néanmoins, l’application de différentes conditions de Eh a permis de démontrer un retardement de l’initiation de la germination en milieu réducteur pouvant apporter une explication des résultats obtenus en fabrication fromagère

Control of butyric acid fermentation by reducing lactic microflora

Parmi les Clostridia, C. tyrobutyricum est l’espèce majeure à l’origine du défaut de gonflement tardif retrouvé chez les fromages à pâte pressée. Il existe différentes méthodes de contrôle ou préventives pour réduire la population de spores de C. tyrobutyricum comme « les bonnes pratiques laitières », un dénombrement des spores de Clostridium dans le lait avant fabrication fromagère ou encore l’ajout d’additifs, l’utilisation de la bactofugation ou de la microfiltration. Cependant, il suffit d’une très faible concentration de spores pour voir apparaître ce défaut. Les résultats du projet Food-Redox ont montré que la modulation de l'environnement redox par des bactéries lactiques réductrices pourrait avoir un impact sur l’apparition du gonflement tardif dans les fromages. L’objectif de cette thèse a été d’étudier l’impact du Eh sur la germination, la croissance et le métabolisme de C. tyrobutyricum.Pour cela, nous avons sélectionné différentes souches de bactéries lactiques en fonction de leur activité réductrice à l’aide de différentes méthodes déjà existantes. En parallèle, nous avons développé une nouvelle méthode de criblage en plaque 96 puits, permettant de discriminer des bactéries lactiques d’une même espèce en fonction de leur activité réductrice via un milieu spécifique supplémenté avec un sel de tétrazolium. Cette méthode a permis de sélectionner des souches de bactéries lactiques selon leur profil de réduction, en culture pure ou en culture mixte.Nous avons utilisé ces différentes bactéries lactiques réductrices dans des fabrications type Emmental contaminées avec des spores de C. tyrobutyricum afin de déterminer l’impact de leur activité réductrice sur le défaut de gonflement tardif. Il s’est avéré que la combinaison d’un lactocoque et d’un lactobacille hétérofermentaire facultatif, tous deux fortement réducteurs, pourrait permettre de retarder l’apparition de l’accident.Nous avons travaillé avec la souche C. tyrobutyricum CIRM BIA 2237 connue pour être capable d’engendrer le gonflement tardif dans les fromages type Emmental. Un séquençage de son génome et des analyses bio-informatiques ont permis de proposer un nouveau schéma métabolique avec le lactate et l’acétate comme seules sources de carbone. L’analyse des flux métaboliques de la fermentation butyrique chez C. tyrobutyricum a permis de valider ce nouveau schéma à partir des métabolites quantifiés à l’état stationnaire d’une fermentation continue. En revanche, l’étude des flux métaboliques de C. tyrobutyricum, à différentes conditions de Eh, n’a pas montré de réel impact de ce paramètre. Néanmoins, l’application de différentes conditions de Eh a permis de démontrer un retardement de l’initiation de la germination en milieu réducteur pouvant apporter une explication des résultats obtenus en fabrication fromagère.One of the main specie leading to late blowing defect in hard and semi-hard cheese amongst Clostridia is C. tyrobutyricum. There are various preventives methods to control or prevent spores contamination from C. tyrobutyricum such as Good Dairy Farming Practice, Clostridium spore counting in milk before cheese making or even adding food additives, the use of bactofugation or microfiltration. However, only a low concentration leads to the late blowing defect. The results of Food-Redox shown that modulating the cheese redox environment by reducing lactic bacteria could have an impact on the occurrence of the late blowing defect. The aim of this Ph.D work was to study the impact of Eh on C. tyrobutyricum germination and metabolism.Therefore, we selected various lactic bacteria strains according to their reducing activity with various exiting methods. In the meantime, we developed a new microplate screening method to discriminate lactic bacteria from a same specie based on their reducing activity through a specific liquid medium supplemented with tetrazolium salt. This selection let us obtain different reduction profile from lactic acid bacteria cultures composed of one or more species.We added these reducing lactic bacteria to Emmental cheesemaking contaminated with C. tyrobutyricum spores in order to determine the impact of their reducing activity on C. tyrobutyricum. It appears that the combination of a Lactococcus and a Lactobacillus, both of which are highly reducing, could delay the onset of the late blowing defect caused by C. tyrobutyricum.We worked with the C. tyrobutyricum CIRM BIA 2237 strain known to be able to induce late blowing defect in Emmental cheeses. Sequencing genome and bioinformatic analyses have led us to propose a new metabolic scheme with lactate and acetate as the only carbon sources. The analysis of the metabolic flows of the butyric fermentation from C. tyrobutyricum allowed to validate this new scheme from metabolites data at steady-state of continuous fermentation.However, the study of metabolic flux analysis from C. tyrobutyricum butyric acid fermentation at different Eh conditions did not really show any impact. On the contrary, the application of different Eh conditions made it possible to demonstrate a delay in the initiation of germination in a reducing environment, which could explain the results obtained in cheesemaking

Bioinformatics and metabolic flux analysis highlight a new mechanism involved in lactate oxidation in Clostridium tyrobutyricum

International audienceClimate change and environmental issues compel us to find alternatives to the production of molecules of interest from petrochemistry. This study aims at understanding the production of butyrate, hydrogen, and CO 2 from the oxidation of lactate with acetate in Clostridium tyrobutyricum and thus proposes an alternative carbon source to glucose. This specie is known to produce more butyrate than the other butyrate-producing clostridia species due to a lack of solvent genesis phase. The recent discoveries on flavin-based electron bifurcation and confurcation mechanism as a mode of energy conservation led us to suggest a new metabolic scheme for the formation of butyrate from lactate-acetate co-metabolism. While searching for genes encoding for EtfAB complexes and neighboring genes in the genome of C. tyrobutyricum , we identified a cluster of genes involved in butyrate formation and another cluster involved in lactate oxidation homologous to Acetobacterium woodii . A phylogenetic approach encompassing other butyrate-producing and/or lactate-oxidizing species based on EtfAB complexes confirmed these results. A metabolic scheme on the production of butyrate, hydrogen, and CO 2 from the lactate-acetate co-metabolism in C. tyrobutyricum was constructed and then confirmed with data of steady-state continuous culture. This in silico metabolic carbon flux analysis model showed the coherence of the scheme from the carbon recovery, the cofactor ratio, and the ATP yield. This study improves our understanding of the lactate oxidation metabolic pathways and the role of acetate and intracellular redox balance, and paves the way for the production of molecules of interest as butyrate and hydrogen with C. tyrobutyricum

Whole-Genome Sequencing and Annotation of Clostridium tyrobutyricum Strain Cirm BIA 2237, Isolated from Silage

International audienceClostridium tyrobutyricum is the main bacterial species leading to the late blowing defect, a major cause of spoilage in semihard and hard cheeses. This study reports the complete genome sequencing, assembly, and annotation of C. tyrobutyricum strain Cirm BIA 2237, formerly called CNRZ 608, isolated from silage

Maitrise de la fermentation butyrique par la microflore lactique réductrice

International audienceClostridium tyrobutyricum, bactérie anaérobie stricte, endosporulée, est à l’origine de l’apparition du défaut appelé «gonflement tardif » lors de l’étape d’affinage de nombreux fromages à pâtes pressées non cuites et cuites. Selon d’Incecco et al. (2018), elle passerait de l’état spore à un état de cellule végétative à la fin de l’étape d’acidification. Par ailleurs dans le projet ANR FoodREDOX, il a été montré qu’un ensemencement dans le lait d’une microflore abaissant le potentiel d’oxydoréduction, ralentirait la consommation de lactates et la production de butyrate par C. tyrobutyricum lors de l’affinage des fromages. Ainsi, connaître et comprendre les mécanismes de germination, sporulation et le métabolisme de cette bactérie, jusque-là encore peu connus ou incomplets, sont nécessaires pour comprendre l’impact d’une microflore réductrice sur ces mécanismes et de trouver un moyen de lutte à l’aide de cette dernière.Dans l’étude bio-informatique que nous avons réalisée, les séquences génomiques et/ou protéiques de protéines clés des différents mécanismes de la souche C. tyrobutyricum KCTC 5387 (ATCC 25755T ) ont été comparées à celles d’autres espèces ou genres bactériens par le biais du logiciel Blast proposé par le site Pubmed. Les résultats ont confirmé la présence des principaux facteurs sigmas et Spo0A du mécanisme de sporulation et tendent vers un mécanisme de germination se rapprochant à celui du genre Bacillus. Pour la fermentation butyrique à partir du lactate, les schémas actuels ne sont pas en totale corrélation avec l’analyse du génome. En effet, certainesenzymes présentent généralement dans les schémas ne le sont pas dans ce dernier, engendrant ainsi undéséquilibre redox. Cependant de nouveaux mécanismes, appelés « Flavin-Based Electron Bifurcation » retrouvés chez C. tyrobutyricum, seraient les éléments manquants pour équilibrer et comprendre le métabolisme chez ce dernier.En conclusion, les facteurs principaux du schéma général de sporulation chez le genre Clostridium sont retrouvés chez C. tyrobutyricum mais les mécanismes intermédiaires restent encore incertains. Le mécanisme de germination tend vers celui du genre Bacillus mais son déclenchement demeure encore inconnu. Enfin, le nouveau schéma métabolique obtenu, après les différentes comparaisons génomiques ou protéiques, doit être validé avec des données de flux métaboliques

Screening of lactic acid bacteria based on their reduction kinetics

International audienceLactic Acid bacteria (LAB) are widespread in the dairy industry for their use as starters and probiotics. They are able to reduce redox potential (E h) of food matrices, influencing oxidation-reduction reactions involved in the organoleptic quality of the product and also preventing the development of undesired microflora. Amongst LAB, some species are able to reduce E h below negative values while others do not [1]. This diversity of reducing activity found in LAB allows the use of selected strains providing optimal reduction values necessary to the overall quality of food dairy products. Currently, there are different ways to compare LAB based on their reducing properties. Cachon et al., 2002 proposed the Potentiometry Reduction Activity Method (PRAM) by monitoring E h in liquid medium with redox probes, and the comparison of the maximum reduction rate (Vmax r), and the time to reach Vmax r. Michelon et al., 2013 proposed the cOlorimetric Reduction CApacity Method (ORCAM), a screening method on solid medium. This later takes advantage over PRAM to allow screening of a lot of strains in a short time. Nevertheless, this method is relatively non-discriminatory between LAB strains belonging to the same species. Consequently, we developed a new method, the Absorbance Reducing Activity Method (ARAM), in order to differentiate strains by keeping the simplicity of ORCAM but with the relevance of bacterial reduction kinetics obtained with PRAM. To validate this new screening method, PRAM using iCinac interface was carried out in parallel as reference method

Screening of Lactococcus lactis starters with Absorbance Reduction Activity Method (ARAm)

International audienceLactococcus lactis is one of the most used species in the dairy industry. This species has the ability to reduce to very negative values the redox potential (Eh) of food matrices, making it one of the most reducing Lactic Acid Bacteria (LAB) [1]. This reducing activity influences oxidation-reduction reactions involved in the organoleptic quality of the product and prevents the undesired microorganisms development [2–4]. The main mechanism involved are exofacial thiol groups, NoxE NADH Oxidase and the Electron Transport Chain mechanism [5-7]. For Eh measurement, the commonly used method consists of a redox probe placed in a liquid medium or food matrix [8]. With this probe, Cachon et al. (2002) proposed an innovative procedure allowing to compare reducing activity of LAB, according to their maximum reduction rate, based on their reduction kinetic vs. time. Despite its accuracy, this method can be complex, time-consuming and expensive for the screening of many strains. Michelon et al. (2013), proposed an agar milk screening using colored oxidation-reduction indicators to quickly categorize, with a reducing power score, a large number of LAB strains. This method was used successfully for screening a large bank of LAB and mutants’ strains. However, while this screening method showed significant inter-species differences, it was difficult to identify intra-species ones [9].In order to differentiate several strains belonging to the same species, we developed a new method combining Cachon et al. (2002) and Michelon et al. (2013) procedures with high throughput screening. This routinely method allows to compare until 30 L. lactis strains simultaneously and can be applied on frozen and freeze-dried mixed starters.1. Brasca et al. 2007. J Appl Microbiol 103,1516–24 2. Caldeo et al. 2016. J Dairy Res 83,479–86 3. Nouaille et al.2014. Appl Environ Microbiol 80,7028–35 4. Abraham et al. 2007. Int Dairy J 17,954–60 5. Michelon et al. 2010. FEBS J 277,2282–906. Tachon et al. 2010. Appl Environ Microbiol 76,1311–9 7. Roussel et al. 2022. Food Res Int 156,1111-548. Cachon et al., 2002. Lait 82,281–8 9. Michelon et al. 2013. J Biosci Bioeng 115,229–3

Criblage des bactéries lactiques en fonction de leur cinétique de réduction : approche méthodologique

Les bactéries lactiques (BL) sont des micro-organismes importants dans l'industrie alimentaire pour la fabrication de produits fermentés ou comme probiotiques. Parmi les BL, certaines espèces sont capables de réduire le potentiel d’oxydoréduction (Eh) jusqu’à des valeurs négatives alors que d'autres non [1]. Cette diversité d'activité réductrice retrouvée chez les BL permet l'utilisation de souches sélectionnées apportant des valeurs de réduction optimales nécessaires à la qualité globale des produits laitiers [2–6]. Les principaux mécanismes impliqués sont les groupes thiol exofaciaux, la NoxE NADH Oxydase et le mécanisme mettant en jeu la chaîne de transport d'électrons [7,8,9].Actuellement, il existe différentes façons de comparer les BL en fonction de leurs propriétés réductrices. Cachon et al 2002 [10] ont proposé une Méthode de mesure Potentiométrique de l'Activité Réductrice (MPAR) par suivi des cinétiques en milieu liquide grâce à des sondes redox. Michelon et al 2013 [11] ont proposé la Méthode cOlorimétrique de mesure de la CApacité Réductrice (MOCAR) par criblage sur milieu solide. Par rapport à MPAR, MOCR permet le criblage d'un grand nombre de souches en peu de temps. Cependant, cette méthode est binaire et discrimine relativement mal les souches d’une même espèce. Par conséquent, nous avons développé une nouvelle méthode, Méthode de mesure par Absorbance de l’Activité Réductrice (MAAR) afin de différencier les souches en gardant la simplicité de MOCAR mais avec la pertinence de la cinétique de réduction bactérienne obtenue avec MPAR. Pour cela, un milieu chimiquement défini a été mis au point pour suivre l’absorbance dans le temps. Onze souches de BL pures ainsi que 3 ferments de L. lactis commerciaux ont été testés avec MAAR et comparés avec la méthode de référence MPAR en utilisant l’interface iCinac. Les paramètres discriminatoires obtenus à partir de la cinétique avec MAAR ont permis de différencier les souches pures d’une même espèce et les starters de la même manière qu’avec MPAR. Cette nouvelle méthode de criblage permet : (1) de différencier simultanément plusieurs souches d’une même espèce en fonction de leur activité réductrice ; (2) la comparaison de souches intra-genre. Ainsi, une utilisation combinée des criblages MOCAR et MAAR permettrait de cribler rapidement plus de souches de BL en fonction de leur potentiel de réduction.References[1]. M Brasca., S. Morandi, R. Lodi, A. Tamburini of J Appl Microbiol, 2007, 10.1111/j.1365-2672.2007.03392.x[2]. V. Caldeo, JA. Hannon, DK. Hickey, D. Waldron, MG. Wilkinson, TP. Beresford of J Dairy Res, 2016, 10.1017/S002202991600056X[3]. F. Martin, N. Cayot, C. Vergoignan, L. Journaux, P. Gervais, R. Cachon of Food Res Int, 2010, 10.1016/j.foodres.2009.09.032[4]. F. Martin, R. Cachon, K. Pernin, J. De Coninck, P. Gervais, E. Guichard of J Dairy Sci, 2011, [5]. S. Nouaille, L. Rault, S. Jeanson, P. Loubière, Y. Le Loir, S. Even of Appl Environ Microbiol 2014, 10.1128/AEM.02287-14[6]. S. Abraham, R. Cachon, B. Colas, G. Feron, J. De Coninck of Int Dairy J, 2007, 10.1016/j.idairyj.2006.12.010[7]. D. Michelon, S. Abraham, B. Ebel, J. De Coninck, F. Husson, G. Feron of FEBS J, 2010, 10.1111/j.1742-4658.2010.07644.x[8]. S. Tachon, JB. Brandsma, M. Yvon of Appl Environ Microbiol, 2010, 10.1128/AEM.02120-09 [9]. C. Roussel, B. Ebel, E. Munier, D. Michelon, F. Martin-Dejardin, E. Beuvier, J. De Coninck, P. Gaudu, R. Cachon of Food Res Int, 2022, 10.1016/j.foodres.2022.111154[10]. R. Cachon, S. Jeanson, M. Aldarf, C. Divies of Le lait, 2002, 10.1051/lait:2002010[11]. D. Michelon, S. Tachon, B. Ebel, J. De Coninck, G. Feron, P. Gervais, M. Yvon, R. Cachon of J Biosci Bioeng, 2013, 10.1016/j.jbiosc.2012.09.01

Influence of pH on Oenococcus oeni metabolism: Can the slowdown of citrate consumption improve its acid tolerance?

International audienceOenococcus oeni is the lactic acid bacteria most suited to carry out malolactic fermentation in wine, converting L-malic acid into L-lactic acid and carbon dioxide, thereby deacidifying wines. Indeed, wine is a harsh environment for microbial growth, partly because of its low pH. By metabolizing citrate, O. oeni maintains its homeostasis under acid conditions. Indeed, citrate consumption activates the proton motive force, helps to maintain intracellular pH, and enhances bacterial growth when it is co-metabolized with sugars. In addition, citrate metabolism is responsible for diacetyl production, an aromatic compound which bestows a buttery character to wine. However, an inhibitory effect of citrate on O. oeni growth at low pH has been highlighted in recent years. In order to understand how citrate metabolism can be linked to the acid tolerance of this bacterium, consumption of citrate was investigated in eleven O. oeni strains. In addition, malate and sugar consumptions were also monitored, as they can be impacted by citrate metabolism. This experiment highlighted the huge diversity of metabolisms between strains depending on their origin. It also showed the capacity of O. oeni to de novo metabolize certain end-products such as L-lactate and mannitol, a phenomenon never before demonstrated. It also enabled drawing hypotheses concerning the two positive effects that the slowing down of citrate metabolism could have on biomass production and malolactic fermentation occurring under low pH conditions

Green strategies to control redox potential in the fermented food industry

International audienceLactic acid bacteria (LAB) are important microorganisms in the food industry as functional starters for the manufacture of fermented food products and as probiotics. Redox potential (Eh) is a parameter of the physicochemical environment of foods that influences key oxidation-reduction reactions involved in process performances and product quality. Eh can be modified by different methods, using redox molecules, catalytic activity of enzymes or LAB themselves, technological treatments like electroreduction or heating, and finally gases. Nowadays new applications for food manufacture must undertake green process innovation. This paper presents the strategies for Eh modification in a sustainable manner for production of LAB biomass (starters, probiotics) and fermented food products (fermented milks, cheeses and others). While the use of chemical or enzymes may be subject to controversy, the use of gases offers new opportunities, in combination with LAB. Protection against food-borne microorganisms, an increasing growth and viability of LAB, and a positive impact on food flavour are expected