The Intragenesis and Synthetic Biology Approach towards Accelerating Genetic Gains on Strawberry: Development of New Tools to Improve Fruit Quality and Resistance to Pathogens

Under climate change, the spread of pests and pathogens into new environments has a dramatic effect on crop protection control. Strawberry (Fragaria spp.) is one the most profitable crops of the Rosaceae family worldwide, but more than 50 different genera of pathogens affect this species. Therefore, accelerating the improvement of fruit quality and pathogen resistance in strawberry represents an important objective for breeding and reducing the usage of pesticides. New genome sequencing data and bioinformatics tools has provided important resources to expand the use of synthetic biology-assisted intragenesis strategies as a powerful tool to accelerate genetic gains in strawberry. In this paper, we took advantage of these innovative approaches to create four RNAi intragenic silencing cassettes by combining specific strawberry new promoters and pathogen defense-related candidate DNA sequences to increase strawberry fruit quality and resistance by silencing their corresponding endogenous genes, mainly during fruit ripening stages, thus avoiding any unwanted effect on plant growth and development. Using a fruit transient assay, GUS expression was detected by the two synthetic FvAAT2 and FvDOF2 promoters, both by histochemical assay and qPCR analysis of GUS transcript levels, thus ensuring the ability of the same to drive the expression of the silencing cassettes in this strawberry tissue. The approaches described here represent valuable new tools for the rapid development of improved strawberry lines

Resistencia frente a Colletotrichum acutatum en frutos de fresa: prueba de función de genes mediante ensayos de expresión transitoria

Trabajo presentado en el XVIII Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología (SEF), celebrado en Palencia del 20 al 23 de septiembre de 2016.La fresa (Fragaria ananassa) es fuente de vitaminas, antioxidantes y metabolitos de múltiples beneficios para la salud. Su producción anual en España (tercer productor mundial) supera 200.000 toneladas (>300 millones euros) y sufre la acción de gran variedad de organismos fitopatógenos que causan importantes pérdidas. En general, las plantas han desarrollado mecanismos de defensa naturales frente al ataque de patógenos. En plantas modelo, existe gran evidencia de que miembros de las familias génicas NPR, WRKY o E3-Ubiquitin ligasas, entre otras, son clave para la activación de rutas moleculares que conducen a la defensa. En fresa, hemos identificados genes homólogos a miembros de dichas familias. Para conocer la verdadera función de dichos genes hemos obtenido construcciones plasmídicas, mediante sistema Gateway, para sobreexpresión/silenciamiento de los mismos en la fresa y hemos desarrollado un sistema de ensayo fitopatológico tras su expresión transitoria en fruto. Así, a frutos de fresa se inyectó (a una mitad del fruto) una suspensión de Agrobacterium tumefaciens portadora de la construcción de interés. A las 48h estos frutos se inocularon con Colletotrichum acutatum en ambas mitades, mediante filtros-disco (5 mm) estériles previamente sumergidos en suspensión de 104conidias/mL. Tras 5 días se realizaron cortes longitudinales desde los puntos de inoculación, evaluándose la penetración fúngica según escala 1-3 (1 fruto sano, 2 penetración moderada y 3 penetración profunda) en cada una de las 2 caras (agroinyectada/no agroinyectada), obteniéndose de esta forma un ratio (valor zona-agroinyectada/valor zona-no agroinyectada) para cada fruto. Análisis preliminares muestran diferencias entre frutos control (no agroinyectados y agroinyectados medio Murashige-Skoog) y frutos agroinyectados con construcciones de genes tipo NPR y WRKY, que permiten implicarlos de forma inequívoca en defensa. Según estos resultados actualmente poseemos un sistema fiable de ensayo de susceptibilidad a C. acutatum, lo que permitirá evaluar la implicación de genes en defensa a este patógeno.Peer Reviewe