Caractérisation et analyse fonctionnelle des snoARN orphelins par la mise au point d'une méthode étudiant les interactions snoARN-ARN cibles

Cellular RNAs carry various post-transcriptionally modified nucleotides that are essential for their folding, stability and interactions. Two highly represented chemical modifications are the pseudouridylations and the 2'-O-ribose methylations, which are guided respectively by H/ACA and C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs). These snoRNAs accumulating in cell nucleoli and Cajal bodies play a crucial role in ribosomal RNA (rRNA) and splicing RNA (snRNA) maturation. In addition to their guiding functions, snoRNAs are involved in other cellular mechanisms such as pre-rRNA cleavage and telomere maintenance. Recent studies suggested that snoRNAs might also target messenger RNAs (mRNAs). Interestingly, more than one-third of known snoRNAs do not have an identified function or an associated mechanism and therefore referred to as "orphan snoRNAs". To address their function, the main objective of my PhD research was to develop an in vivo method for co-purification of a snoRNA with its interacting RNAs in order to identify its possible targets. Identifying the RNAs targeted by orphan snoRNAs is crucial for understanding their cellular role. The method I developed involved RNA-RNA crosslinking using psoralen. Subsequent purification of the snoRNA of interest allowed the specific co-purification of physically bound target RNAs. Fragmentation of the purified RNAs was followed by a proximity ligation step that joined spatially close RNA fragments. This process generated chimeric RNAs composed of (i) a fragment from the orphan snoRNA of interest and (ii) a fragment from a co-purified putative target RNA. These chimeric RNAs were used then to create a complementary DNA (cDNA) library, which was sequenced. Analysis of the sequencing data enabled us the identification of RNAs co-purified with the snoRNA. Although some aspects of this method still require further refinement, I was able to provide additional information on (i) the interaction between the snoRNA SNORD115, associated with Prader-Willi syndrome, and the putative target mRNA 5-HT2C and (ii) the interaction between SNORA55, a highly conserved orphan snoRNA, and the 18S rRNA. Furthermore, during my doctoral studies, I had the opportunity to extensively study the molecular characteristics of H/ACA snoRNAs. Through immunoprecipitation of one of the core proteins of the H/ACA complexes, I was able to identify and examine the accumulation of new H/ACA snoRNAs. My results showed that, to date, almost all H/ACA snoRNAs present in human cells have been discovered by the scientific community. However, I was able to identify a new H/ACA snoRNA, named H/ACA 186, located in a genomic region that is atypical for a snoRNA. The H/ACA 186 gene, overlapping an intronic and an exonic region, could be associated to a novel mechanism of snoRNAs, namely the regulation of its host gene. Additionally, by developing genetic tools, contributed to the demonstration that four human H/ACA snoRNAs were capable, through conformational rearrangement, of catalyzing the isomerization of two consecutive uridines on the same target RNA. These results highlight the extraordinary diversity of mechanisms associated with H/ACA snoRNAs in human cells.Les ARN cellulaires portent de nombreuses modifications post-transcriptionnelles nécessaires à leur repliement, leur stabilité, et aux interactions dans lesquelles ils sont impliqués. Parmi ces modifications chimiques, les pseudouridylations et les méthylations en 2'-O-ribose sont respectivement guidés par les petits ARN nucléolaires (snoARN) des classes H/ACA et C/D. Via ces modifications chimiques, ces ARN, présent dans les nucléoles et les corps de Cajal des cellules, jouent un rôle primordial dans la maturation des ARN ribosomiques (ARNr) et des ARN de l'épissage (ARNsn). En supplément de ces fonctions de guide, les snoARN sont impliqués dans d'autres mécanismes cellulaires, tels que le clivage des pré-ARNr ou le maintien des télomères. Récemment, plusieurs travaux laissent émerger l'idée que les snoARN cibleraient les ARN messagers (ARNm). Allant dans ce sens, plus d'un tiers des snoARN répertoriés n'ont pas encore de fonctions ou de mécanismes associés. Ils sont philosophiquement nommés "snoARN orphelins". Les snoARN interagissant physiquement par appariement direct de paires de base avec les ARN qu'ils ciblent, le principal objectif de ma thèse a été de mettre au point une méthode de co-purification in vivo d'un snoARN avec sa ou ses cibles, de manière à pouvoir les identifier. L'identification des ARN ciblés par les snoARN orphelins se trouve être une information cruciale afin de pouvoir associer un rôle à ces snoARN, et ainsi pouvoir comprendre la place qu'ils occupent au sein de la machinerie cellulaire. Dans cette optique, la méthode mise au point durant mon doctorat consiste en premier lieu à un pontage au psoralène des interactions ARN-ARN au sein de ces cellules. La purification ultérieure d'un snoARN d'intérêt permet alors de co-purifier spécifiquement les ARN cibles physiquement liés à ce dernier. Les ARN obtenus sont fragmentés, puis une étape de ligation de proximité permet de relier entre elles les extrémités des fragments d'ARN proches spatialement. Des ARN chimériques sont alors générés, composés (i) d'un fragment appartenant au snoARN orphelin d'intérêt (ii) d'un fragment d'un ARN cible putatif co-purifié avec le snoARN. Ces ARN chimériques servent ensuite de modèle pour la synthèse d'une librairie d'ADN complémentaire (ADNc) qui est séquencée à haut débit. L'analyse des données obtenues permet l'identification des ARN co-purifiés avec le snoARN. Même si différents aspects de cette méthode restent à peaufiner, j'ai notamment pu apporter, au cours de ma thèse, des informations supplémentaires concernant (i) l'interaction entre le snoARN SNORD115, impliqué dans le syndrome de Prader-Willi, et le putatif ARNm cible 5-HT2C (ii) l'interaction entre SNORA55, un snoARN orphelin fortement conservé au cours de l'évolution, et l'ARNr 18S. D'autre part, au cours de mon doctorat, j'ai eu l'opportunité d'étudier en profondeur les caractéristiques moléculaires des snoARN H/ACA. Via une immunoprécipitation d'une des protéines cœurs des complexes H/ACA, j'ai pu identifier et tester l'accumulation de nouveaux snoARN H/ACA. Mes résultats ont montré qu'à ce jour, la quasi-totalité des snoARN H/ACA présent dans les cellules humaines ont été découvert par la communauté scientifique. Cependant, j'ai pu identifier un nouveau snoARN H/ACA, nommé H/ACA 186, situé dans une région génomique atypique pour un snoARN. Le gène H/ACA 186, chevauchant une région intronique et une région exonique, pourrait être associé à un nouveau mécanisme d'action des snoARN, comme la régulation de son gène hôte. Également, de par la création d'outils génétiques, j'ai pu participer à démontrer que quatre snoARN H/ACA humains étaient capables, par un réarrangement conformationnel, de réaliser l'isomérisation de deux Uridines consécutives sur un même ARN cible. Ces résultats mettent en valeur l'extraordinaire diversité des mécanismes associés aux snoARN H/ACA dans les cellules humaines

Guide RNA acrobatics: positioning consecutive uridines for pseudouridylation by H/ACA pseudouridylation loops with dual guide capacity

International audienceSite-specific pseudouridylation of human ribosomal and spliceosomal RNAs is directed by H/ACA guide RNAs composed of two hairpins carrying internal pseudouridylation guide loops. The distal “antisense” sequences of the pseudouridylation loop base-pair with the target RNA to position two unpaired target nucleotides 5′-UN-3′, including the 5′ substrate U, under the base of the distal stem topping the guide loop. Therefore, each pseudouridylation loop is expected to direct synthesis of a single pseudouridine (Ψ) in the target sequence. However, in this study, genetic depletion and restoration and RNA mutational analyses demonstrate that at least four human H/ACA RNAs (SNORA53, SNORA57, SCARNA8, and SCARNA1) carry pseudouridylation loops supporting efficient and specific synthesis of two consecutive pseudouridines (ΨΨ or ΨNΨ) in the 28S (Ψ3747/Ψ3749), 18S (Ψ1045/Ψ1046), and U2 (Ψ43/Ψ44 and Ψ89/Ψ91) RNAs, respectively. In order to position two substrate Us for pseudouridylation, the dual guide loops form alternative base-pairing interactions with their target RNAs. This remarkable structural flexibility of dual pseudouridylation loops provides an unexpected versatility for RNA-directed pseudouridylation without compromising its efficiency and accuracy. Besides supporting synthesis of at least 6% of human ribosomal and spliceosomal Ψs, evidence indicates that dual pseudouridylation loops also participate in pseudouridylation of yeast and archaeal rRNAs

La mise en œuvre des élévations et des voûtes de Notre-Dame de Paris : bilan des recherches et des protocoles en cours

[À paraître]International audienc