Failed immune responses across multiple pathologies share pan-tumor and circulating lymphocytic targets

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) are widely associated with positive outcomes, yet carry key indicators of a systemic failed immune response against unresolved cancer. Cancer immunotherapies can reverse their tolerance phenotypes while preserving tumor reactivity and neoantigen specificity shared with circulating immune cells. We performed comprehensive transcriptomic analyses to identify gene signatures common to circulating and TILs in the context of clear cell renal cell carcinoma. Modulated genes also associated with disease outcome were validated in other cancer types. Through comprehensive bioinformatics analyses, we identified practical diagnostic markers and actionable targets of the failed immune response. On circulating lymphocytes, 3 genes (LEF1, FASLG, and MMP9) could efficiently stratify patients from healthy control donors. From their associations with resistance to cancer immunotherapies and microbial infections, we uncovered not only pan-cancer, but pan-pathology, failed immune response profiles. A prominent lymphocytic matrix metallopeptidase cell migration pathway is central to a panoply of diseases and tumor immunogenicity, correlates with multi-cancer recurrence, and identifies a feasible noninvasive approach to pan-pathology diagnoses. The differentially expressed genes we have identified warrant future investigation into the development of their potential in noninvasive precision diagnostics and precision pan-disease immunotherapeutics. - 2019, American Society for Clinical Investigation.We thank all study participants and patients; The Cancer Genome Atlas; Mathieu Latour and Roula Albadine and supporting staff of the CHUM pathology department; Manon de Ladurantaye and Anne-Marie Mes-Masson from the CRCHUM for RNA quality profiling, Geneviève Cormier and Fred Saad from the CRCHUM for drawing blood from control donors; Gilles Corbeil of the CRCHUM genomics department for RNA quality testing and microarray profiling; Francois Harvey of the CRCHUM bioinformatics department; Peter Graf and Patrick Sabourin from Affymetrix for providing reagents and technical assistance; Zeeshan Farroq and Ofir Goldberger from Fluidigm; Erika Diaz from StemCell; Andrew Mouland from McGill University; Simon Turcotte from University of Montreal; and Sascha Ring from Biostars for their advice. This work was partially performed at the Institut du Cancer de Montréal CRCHUM and University of Montreal, in Montreal, Quebec, Canada. This work was supported by a Canadian Cancer Society Research Institute grant (CCSRI) (702036, to RL and IJ) and a Biomedical Research Grant from the Kidney Foundation of Canada (KFOC130019 to RL). RL is supported by the Quebec Cell, Tissue and Gene Therapy Network—ThéCell (a thematic network supported by the Fonds de recherche du Québec–Santé [FRQS]), the FRQS, and the Immunotherapy Network (iTNT) from the Terry Fox Research Institute (TFRI), A. Monette is supported by Mitacs, Merck, l’Institut du cancer de Montréal (ICM), the Society for Immunotherapy of Cancer, and the Lady Davis Institute for Medical Research. NAB is supported by the FRQS post-doctoral award and Qatar University. JBL is supported by l’Institut du Cancer de Montréal. JPR holds the Louis Lowenstein Chair, McGill University. DEK is supported by an FRQS Research Scholar Award (grant 31035), CIHR 377124, NHLBI RO1-HL-092565, and the Canada Foundation for Innovation (CFI) (grant 31756). IJ and computational analysis were supported by the Canada Research Chair Program (CRC) (grant 225404), Ontario Research Fund (grant 34876), the Natural Sciences Research Council (NSERC) (grant 203475), the CFI (grants 203373 and 30865), the Krembil Foundation, and IBM.Scopu

The impact if the interaction of gp120 of HIV-1 with receptor CCR5 on cellular and molecular level

The asymptomatic phase of HIV-1 infection is characterized by a progressive depletion of uninfected peripheral effector/memory CD4+ T cells that subsequently leads to immune dysfunction and AIDS symptoms. Nevertheless, the precise mechanism of by which the virus depletes uninfected CD4+ T cells, the so called bystander effect, remains elusive. Previous studies of our research group suggest that proteins of the viral envelope participate in an “immune-viral” synapse between HIV-1 infected macrophages and CD4+ T cells during antigen presentation. At the synapse, the third hypervariable (V3) domain of HIV-1 envelope glycoprotein gp120 interacts with the chemokine receptor CCR5 inducing an accelerated and enhanced type of apoptosis, called activation-induced cell death (AICD), of the responding CD4+ T cells. It was also demonstrated that the V3-CCR5 interaction is ionic and it is governed by positively charged residues of the V3 peptide and negatively charged peptides on the amino terminal domain of CCR5, the impetus of this interaction being dependent on the charge of V3. It was also shown that synthetic V3 peptides can inhibit the AICD of CD4+ T cells, but also prevent the infection of primary cells by ΗΙV-1. The present study aimed at the unveiling of the initial signaling molecules triggered by the interaction of V3 epitope with the CCR5 receptor which lead the responding CD4+ T cells in immune dysfunction of and the elucidation of the role of V3 epitope in the phenomenon of AICD of uninfected CD4+ T cells. In order to reproduce the biological phenomenon in vitro, we exposed macrophages to linear synthetic lipopeptides from the crown of V3 presented on liposomes and then we induced antigen presentation complex formation with CD4+ T cells via a superantigen presentation system. The impact of the HIV-1/V3 epitope on the transcriptional profile of a CD4+ enriched T cell population during antigen presentation was determined by oligonucleotide microarrays. The microarrays analysis revealed that 440 genes were affected in transcriptional level by the presence of V3 epitope; 378 were up-regulated, 18 of which for at least 10-fold, and 62 were down-modulated. The most significantly up- and down- regulated transcripts could almost entirely be categorized as related to cell cycle the transcriptional regulation. Functional classification of significantly modulated genes and identification of canonical pathways and functional gene networks analysis were performed by an Ingenuity Pathways Analysis (IPA) platform and overrepresentation of functional ontologies by DAVID Bioinformatics Resources. The statistically significant enriched categories of genes and networks identified by IPA were related to cell cycle, gene expression, immune response, infection’s mechanisms, cell growth, proliferation and the process of antigen presentation. Interestingly, the CD28 signaling pathway was significantly subverted by the V3 epitope. Taken together, these results provide evidence for a hyper-proliferative gene expression signature, triggered by V3-CCR5 interaction in responding CD4+ T cells during antigen presentation that could account for AICD of uninfected CD4+ T cells in HIV-1 infection. As cell cycle was prominent among all classifications according to the bioinformatics analysis, we further assessed the impact of V3 epitope on the progression of cell cycle. The cell cycle state of a CD4+ enriched population treated with the V3 epitope was characterized by flow cytometry and an increase in the percentage of cells in S and G2/M phases was observed. The protein levels of MKi67, which plays a pivotal role in cell proliferation, were evaluated by fluorescence microscopy and the observed increase of MKi67 positive T cells in response to V3 confirmed the results of microarrays concerning the transcriptional up-regulation of MKi67. The mRNA expression of CCNB1 gene, which encodes for a regulatory protein expressed in G2/M phase and involved in mitosis, was also elevated in response to V3 suggesting that CCNB1 may play a crucial role in cell cycle deregulation. Of special interest was also the striking upregulation of NOC2L, which is novel gene that affects cell cycle progression regulating transcription of p21 and inhibits apoptosis mediated by p53 and p63. The kinetic analysis of mRNA expression shows that the up-regulation of the transcriptional levels was followed by a sharp down-regulation, that could account for the observed cell death of uninfected CD4+ T cells. Interestingly, it was shown that V3 epitope also subverts CD28 signaling pathway, which is a major driver of positive immune response eliciting sustained expression of IL2. Our studies were focused on the role of the transcriptional factor NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5) which exhibited extensive transcriptional up-regulation in response to V3 epitope according to microarray analysis. The kinetic analysis of the mRNA expression of NFAT5 by real-time PCR confirmed the increase in the transcriptional levels of NFAT5, and the enhanced protein expression was confirmed by western blotting and flow cytometry. Assessing the functional involvement of NFAT5, it was shown that cyclosporine A, which inhibits the NFAT activationr, interfered with the proliferative promotion of V3 to CD4+ T cells supporting the role of NFAT5 in the V3 phenomenon. The evaluation of the transcriptional expression of IL2, which is characteristic of the activation of CD28 signaling pathway showed enhanced expression of IL2 mRNA confirming the alternation of CD28 signaling pathway by V3 at functional level. Taken together, our results suggest that during antigen presentation the V3 epitope impairs cell cycle progression of CD4+ T cells promoting cells in S and G2/M phase by altering the transcriptional levels of NOC2L, CCNB1, and MKi67 and subverts the CD28 signaling pathway, increasing the transcriptional levels of NFAT5 and of IL2. Due to the clinical relevance of our studies, there was a prerequisite to extend our findings in HIV-1 infected individuals. In experiments performed at Dr Kaufmann’s laboratory at Ragon Institute of MGH, Harvard & MIT in Boston, we assessed the transcriptional levels of selected genes that emerged from transcriptome analysis of our in vitro model in CD4+ T cells of HIV infected individuals with different disease status. The evaluation of the selected genes (NOC2L, MKI67, CCNB1, CCND2, PDPK1, NFAT5, PI3KR1, PAK1, IFI6) in HIV-infected subjects at different state of disease could provide valuable information on the immune components involved in depletion of uninfected CD4+ T cells during HIV infection and enable us to identify the intracellular pathways that are involved in the V3-induced cell death of uninfected CD4+ T cells. A statistically significant reduction in the transcriptional levels of NOC2L was observed in HIV-1 infected individuals in comparison with healthy donors and NOC2L mRNA expression was adversely correlated to viral load. It was also demonstrated that HIV-1 subjects had significantly elevated MKi67 mRNA levels in relationship with HIV-1 negative individuals and there is a significant direct correlation to viral load. Of interest, elite controllers exhibited increased transcriptional levels of MKi67 and CCNB1 genes, which both encode for key molecules in cell cycle progression. Taken together, these data suggest that the cell cycle progression is impaired in HIV-1 infected individuals determining the disease stage. V3 epitope re-immerged as a promising target for neutralizing antibodies when the 3D structure was recently revealed. However, its precise role in HIV infection remains elusive. The delineation of the molecular mechanism by which V3 epitope condemns the uninfected CD4+ T cells to AICD is of major interest as it may account for progressive CD4+ T cell decline during the asymptomatic phase. The findings of the present study provide evidence for a hyperproliferative gene expression signature, triggered by V3-CCR5 interaction in responding CD4+ T cells during antigen presentation. The evaluation of transcriptional levels of genes implicated in V3 signaling in CD4+ T cells in HIV-infected patients of different disease status shed light on genes involved in regulation of cell cycle. Unveiling the key participating molecules in intracellular signaling within the responding CD4+ T cells may provide the impetus to design novel therapeutic strategies such as the salvaging of uninfected T cells from HIV-induced AICD.Η ασυμπτωματική φάση της μόλυνσης από τον HIV-1 χαρακτηρίζεται από τη σταδιακή μείωση του πληθυσμού των μη μολυσμένων περιφερικών CD4+ Τ κυττάρων που οδηγεί σε ανοσοανεπάρκεια και στην εκδήλωση των συμπτωμάτων του AIDS. Εντούτοις, ο ακριβής μηχανισμός αυτής της κυτταροπαθογένειας δεν είναι πλήρως κατανοητός. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν προηγηθεί από την ερευνητική ομάδα μας, έχει προταθεί ότι οι πρωτεΐνες του ιικού φακέλου συμμετέχουν σε μία ιδιότυπη «ανοσο-ιική σύναψη» μεταξύ του μολυσμένου με HIV μακροφάγου και CD4+ Τ κυττάρων κατά την αντιγονοπαρουσίαση. Στη σύναψη, η V3 περιοχή της gp120 αλληλεπιδρά τουλάχιστον με τον υποδοχέα χημειοκινών CCR5 και επάγει μία μορφή ταχείας και ενισχυμένης απόπτωσης, που ονομάζεται AICD (activation-induced cell death) στα αποκρινόμενα CD4+ Τ κύτταρα. Έχει δειχθεί η ιοντική φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των θετικά φορτισμένων αμινοξέων στην V3 περιοχής και των αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων του ελεύθερου αμινοτελικού άκρου του CCR5 και ότι συνθετικά φορτισμένα V3 πεπτίδια μπορούν να αναστείλουν τον AICD των CD4+ T κυττάρων, αλλά να παρεμποδίσουν την μόλυνση πρωτογενών κυττάρων από τον HIV. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η αποκρυπτογράφηση των αρχικών σηματοδοτικών μορίων που πυροδοτούνται από την αλληλεπίδραση του επίτοπου V3 με τουλάχιστον τον συνυποδοχέα CCR5 προκαλώντας ανοσολογική δυσλειτουργία των αποκρινόμενων CD4+ T κυττάρων και η διερεύνηση του ρόλου του επιτόπου V3 στο μη φυσιολογικό φαινόμενο του επαγώμενου από ενεργοποίηση κυτταρικού θανάτου μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων. Για να αναπαραχθεί το βιολογικό φαινόμενο in vitro, πρωτογενή μακροφάγα εκτέθηκαν σε λιποσώματα τα οποία έφεραν στην επιφάνειά τους γραμμικά, συνθετικά λιποπεπτίδια από το στέμμα του V3 και προκλήθηκε ο σχηματισμός συμπλόκου αντιγονοπαρουσίασης μεταξύ των μακροφάγων και CD4+ T κυττάρων μέσω ενός συστήματος ψευδοαντιγονοπαρουσίασης. Η επίδραση του επιτόπου HIV-1/V3 στο μεταγραφικό προφίλ σε ένα CD4+ εμπλουτισμένο Τ κυτταρικό πληθυσμό κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης προσδιορίστηκε με τη χρήση μικροσυστοιχιών συμπληρωματικού DNA. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι 440 γονίδια επηρεάστηκαν σε επίπεδο mRNA από την παρουσία του V3 (>2.0 fold-change, p<0,05, t-test): 378 γονίδια αύξησαν τα μεταγραφικά τους επίπεδα, από τα οποία μάλιστα 18 παρουσίασαν αύξηση τουλάχιστον 10 φορές, ενώ για 62 γονίδια παρατηρήθηκε μείωση. Tα γονίδια τα οποία παρουσίασαν τις εκτενέστερες μεταγραφικές μεταβολές σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τη μεταγραφική ρύθμιση. Ακολούθησε η λειτουργική κατηγοριοποίηση των σημαντικά τροποποιημένων γονιδίων και η αναγνώριση των τροποποιημένων αναγνωρισμένων μονοπατιών και λειτουργικών δικτύων με τη χρήση της πλατφόρμας Ingenuity Pathways Analysis (IPA) platform και η υπεραντιπροσώπευση λειτουργικών οντολογιών με τη βοήθεια του DAVID Bioinformatics Resources. Οι στατιστικά σημαντικότερες εμπλουτισμένες κατηγορίες και δίκτυα που αναγνωρίστηκαν από το ΙΡΑ αφορούσαν τον κυτταρικό κύκλο, τη γονιδιακή έκφραση, την ανοσολογική απάντηση, τους μηχανισμούς μόλυνσης, την κυτταρική αύξηση, τον πολλαπλασιασμό και την αντιγονοπαρουσίαση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι επίτοπος V3 μεταβάλλει το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω του συνυποδοχέα CD28. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα πρότυπο γονιδιακής έκφρασης που υποστηρίζει τον υπερπολλαπλασιασμό, που πυροδοτείται από την αλληλεπίδραση V3-CCR5 στα CD4+ Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης και το οποίο θα μπορούσε να λογοδοτήσει για τον AICD μη μολυσμένων CD4+ Τ κυττάρων στη μόλυνση από τον HIV-1. Καθώς ο κυτταρικός κύκλος ήταν η σημαντικότερη λειτουργία του κυττάρου που τροποποιήθηκε από το V3 σύμφωνα με την ανάλυση της βιοπληροφορικής, μελετήθηκε η επίδραση του V3 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων. Το στάδιο του κυτταρικού κύκλου ενός CD4+ εμπλουτισμένου κυτταρικού πληθυσμού που έχει επωαστεί με τον επίτοπο V3 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής και παρατηρήθηκε μία αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις S και G2/M όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με τον επίτοπο V3. Η πρωτεϊνική έκφραση της MKi67, η οποία διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη φάση του πολλαπλασιασμού, εκτιμήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού, και η παρατηρηθείσα αύξηση των MKi67 θετικών Τ κυττάρων σε απάντηση στον επίτοπο V3 επιβεβαίωσε το αποτέλεσμα των μικροσυστοιχιών αναφορικά με τη μεταγραφική αύξηση του γονιδίου ΜΚi67. Τα μεταγραφικά επίπεδα του γονιδίου της CCNB1, το οποίο κωδικοποιεί για μία ρυθμιστική πρωτεΐνη που εκφράζεται στη φάση G2/M ελέγχοντας τη μίτωση, παρουσίασαν αύξηση σε απόκριση στο V3 προτείνοντας ότι η CCNB1 ίσως συμβάλλει καταλυτικά στην απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η θεαματική αύξηση των επιπέδων mRNA του NOC2L, ενός πρόσφατα ανακαλυμμένου γονιδίου το οποίο επηρεάζει τη λειτουργία του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζοντας τη μεταγραφή μέσω p21 και αναστέλλει την απόπτωση μέσω p53 και p63. Η κινητική μελέτη των επιπέδων mRNA του NOC2L η οποία έδειξε αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων που ακολουθείτο από μία απότομη μείωση, θα μπορούσε να διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στον παρατηρούμενο κυτταρικό θάνατο κατά τη μόλυνση από τον HIV-1. Λόγω του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει η τροποποίηση του CD28 συνδιεγερτικού μονοπατιού από τον επίτοπο V3 καθώς ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση αυξάνοντας τη μεταγραφική έκφραση της IL2, μελετήθηκε περαιτέρω το μόριο με τη μεγαλύτερη μεταγραφική αύξηση σύμφωνα με τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών, που συμμετέχει στο μονοπάτι αυτό, ο μεταγραφικός παράγοντας NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5). Η κινητική ανάλυση των μεταγραφικών επιπέδων του ΝFAT5 με ημιποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου επιβεβαίωσε την αύξηση των mRNA του ΝFAT5, και η αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση της επιβεβαιώθηκε με western blotting και κυτταρομετρία ροής. Για να επιβεβαιωθεί η βιολογική δράση του NFAT5 στο V3 φαινόμενο, χρησιμοποιήθηκε η κυκλοσπορίνη Α (cyclosporine A, CsA) η οποία παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των NFAT. Σε τεχνικές μέτρησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δείχθηκε ότι η CsA επομένως δύναται να αναστείλει το V3 φαινόμενο, γεγονός που υποστηρίζει τον πρωταγωνιστικό ρόλο του ΝFΑΤ5 στο φαινόμενο. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων της ιντερλευκίνης 2, το τελικό αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του CD28 μονοπατιού, απέδειξε αύξηση της μεταγραφικής έκφρασης της ιντερλευκίνης 2, επιβεβαίωνοντας την τροποποίηση του CD28 μονοπατιού από V3 σε λειτουργικό επίπεδο. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν ότι κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης το V3 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων μεταβάλλοντας τα μεταγραφικά επίπεδα των NOC2L, CCNB1 και MKi67, με αποτέλεσμα την αύξηση των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις πολλαπλασιασμού S και της G2/M, και φαλκιδεύει το μονοπάτι του CD28, επιτείνοντας κυρίως τη μεταγραφή των NFAT5 και IL2. Λόγω της κλινικής σημασίας της μελέτης μας, ήταν επιβεβλημένο να επεκτείνουμε τα ευρήματα μας σε άτομα μολυσμένα από τον HIV-1 χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο του Dr Kaufmann στο Ragon Institute of MGH, Harvard & MIT στη Βοστόνη εκτιμήθηκαν τα μεταγραφικά επίπεδα επιλεγμένων γονιδίων που αναδύθηκαν από την ανάλυση του μεταγραφώματος των CD4+ T κυττάρων στο in vitro μοντέλο, σε ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της ασθένειας. H μελέτη της έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (NOC2L, MKI67, CCNB1, CCND2,PDPK1 NFAT5, PI3KR1, PAK1, IFI6) σε ΗIV-1 μολυσμένα άτομα με υψηλό ιικό φορτίο (VL), σε ΗΙV-1 μολυσμένα άτομα σε θεραπεία, και σε elite controllers αποκαλύπτει πολύτιμες πληροφορίες για τα ανοσολογικά στοιχεία που εμπλέκονται στη δραματική μείωση των μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων κατά τη μόλυνση με τον HIV. Ανάμεσα στα πιο σημαντικά αποτελέσματα ήταν η στατιστικά σημαντική μείωση των μεταγραφικών επιπέδων του NOC2L σε άτομα που έχουν μολυνθεί από τον HIV-1 σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, και δείχθηκε ότι η ποσότητα του mRNA συνδέεται αντιστρόφως ανάλογα με το ιικό φορτίο. Επίσης δείχθηκε ότι τα HIV-1(+) άτομα είχαν αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα για το Ki67 σε σχέση με τους υγιείς δότες και υπήρχε άμεση συσχέτιση με το ιικό φορτίο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι οι elite controllers έχουν υψηλή έκφραση επίπεδο μεταγραφής των γονιδίων Κi67 και CCNB1, τα οποία κωδικοποιούν για μόρια κλειδιά στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν πως ο HIV-1 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων και τοιουτοτρόπως ίσως επηρεάζει την πορεία της ασθένειας. O επίτοπος V3 έχει επανέλθει στο προσκήνιο ως στόχος εξουδετεροποιητικών αντισωμάτων, όταν πρόσφατα προσδιορίστηκε η τρισδιάταση δομή της. Εντούτοις, ο ακριβής ρόλος του V3 παραμένει αινιγματικός. Η σκιαγράφηση των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων το V3 καταδικάζει τα μη μολυσμένα CD4+ T κύτταρα σε AICD καθίσταστη επιβεβλημένη, καθώς θα μπορούσε να λογοδοτήσει για την προοδευτική ελάττωση των των CD4+ Τ κυττάρων, παρά το γεγονός ότι μόνο το 0,001-0,1% των Τ κυττάρων είναι μολυσμένα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προσδίδουν ενδεικτικά στοιχεία για τη διαμόρφωση ενός μεταγραφικού προφίλ που οδηγεί τα CD4+ Τ κύτταρα σε υπερπολλαπλασιασμό από την συνδιέγερση του V3 μέσω του CCR5 κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων γονιδίων που επηρεάζονται από το V3 σε CD4+ T κύτταρα από μολυσμένα με HIV-1 άτομα υπογράμμισε τη ρόλο γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ο προσδιορισμός των μορίων-κλειδιά που συμμετέχουν στη σηματοδότηση μέσω V3 στα CD4+ HIV, δύναται να οδηγήσει στο σχεδιασμό καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών κατά του AIDS

Distinctive features of CD4+ T cell dysfunction in chronic viral infections

Broad and 10th Streets, Richmond, VA 23219exterior, façad

RNA flow cytometric FISH for investigations into HIV immunology, vaccination and cure strategies

Abstract Despite the tremendous success of anti-retroviral therapy (ART) no current treatment can eradicate latent HIV reservoirs from HIV-infected individuals or generate, effective HIV-specific immunity. Technological limitations have hampered the identification and characterization of both HIV-infected cells and HIV-specific responses in clinical samples directly ex vivo. RNA-flow cytometric fluorescence in situ hybridisation (RNA Flow-FISH) is a powerful technique, which enables detection of mRNAs in conjunction with proteins at a single-cell level. Here, we describe how we are using this technology to address some of the major questions remaining in the HIV field in the era of ART. We discuss how CD4 T cell responses to HIV antigens, both following vaccination and HIV infection, can be characterized by measurement of cytokine mRNAs. We describe how our development of a dual HIV mRNA/protein assay (HIVRNA/Gag assay) enables high sensitivity detection of very rare HIV-infected cells and aids investigations into the translation-competent latent reservoir in the context of HIV cure

The Downregulation of GFI1 by the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2 Axis and by Human Cytomegalovirus (HCMV) Associated Factors Allows the Activation of the HCMV Major IE Promoter and the Transition to Productive Infection

<div><p>Earlier studies had suggested that epigenetic mechanisms play an important role in the control of human cytomegalovirus (HCMV) infection. Here we show that productive HCMV infection is indeed under the control of histone H3K27 trimethylation. The histone H3K27 methyltransferase EZH2, and its regulators JARID2 and NDY1/KDM2B repress GFI1, a transcriptional repressor of the major immediate-early promoter (MIEP) of HCMV. Knocking down EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 relieves the repression and results in the upregulation of GFI1. During infection, the incoming HCMV rapidly downregulates the GFI1 mRNA and protein in both wild-type cells and in cells in which EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 were knocked down. However, since the pre-infection levels of GFI1 in the latter cells are significantly higher, the virus fails to downregulate it to levels permissive for MIEP activation and viral infection. Following the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2-independent downregulation of GFI1 in the early stages of infection, the virus also initiates an EZH2-NDY1/ΚDM2Β-JARID2-dependent program that represses GFI1 throughout the infection cycle. The EZH2 knockdown also delays histone H3K27 trimethylation in the immediate early region of HCMV, which is accompanied by a drop in H3K4 trimethylation that may contribute to the shEZH2-mediated repression of the major immediate early HCMV promoter. These data show that HCMV uses multiple mechanisms to allow the activation of the HCMV MIEP and to prevent cellular mechanisms from blocking the HCMV replication program.</p></div

Infection by HCMV depends on the downregulation of GFI1, a repressor of immediate-early gene transcription.

<p>Model summarizing the data on the interaction between the virus and the host. (Panel A) This panel describes the infection of wild type HFFs. The incoming virus rapidly degrades GFI1 to allow the activation of the MIEP of HCMV, and viral infection. In addition, virus infection alters the expression of NDY1/KDM2B, EZH2, JARID2 and JMJD3. The solid lines from these molecules to GFI1 indicate that they actively repress GFI1 both before and after infection, although due to HCMV-induced changes in their expression, the repression is enhanced after infection. (Panel B, Left) The repression of GFI1 in uninfected cells was blocked by the knockdown of NDY1/KDM2B, EZH2 or JARID2 and by the overexpression of JMJD3, resulting in significant up-regulation of GFI1 (dotted lines). (Panel B, Right) describes the infection of HFFs in the left side of panel B. The virus continues to degrade GFI1. However, the degradation of GFI1 by the virus is insufficient to downregulate it to levels that allow the activation of the MIEP and viral infection.</p

Primers set used for ChIP analysis.

<p>Primers set used for ChIP analysis.</p

Lentiviral and retroviral constructs used.

<p>Lentiviral and retroviral constructs used.</p

Primer sets used in Real-Time PCR.

<p>Primer sets used in Real-Time PCR.</p

GFI1 mRNA and protein are degraded rapidly during HCMV infection and their degradation is followed by upregulation of EZH2, JARID2 and NDY1/KDM2B and downregulation of JMJD3.

<p><b>A</b>. The GFI1 mRNA levels in lysates of HFFs harvested at the indicated time points after HCMV infection were monitored by real time RT-PCR. <b>B</b>. The GFI1 protein levels in the same cells were monitored by western blotting. <b>C</b>. HCMV infection promotes the degradation of GFI1 at the RNA level. HFFs were mock-infected or infected with HCMV after treatment with Actinomycin D (5 µg/ml). GFI1 mRNA levels in cell lysates harvested at the indicated time points after exposure to the virus were measured by real time RT-PCR. <b>D</b>. Proteasomal inhibition blocks the rapid downregulation of GFI1 in HCMV-infected cells. HFFs were mock-infected or infected with HCMV after pretreatment with MG132 (10 µM). GFI1 protein levels in cell lysates harvested at the indicated time points after exposure to the virus were measured by western blotting. <b>E</b>. GFI1 protein levels in HFFs transduced with the indicated constructs and harvested before, and 2 hours after HCMV infection, were measured by western blotting. <b>F</b>. The expression of EZH2, NDY1/KDM2B, JARID2 and JMJD3 was measured by real time RT-PCR in lysates of HFFs, harvested at the indicated time points after HCMV infection.</p