Prevalência e fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. e comparação de protocolos de nPCR para a detecção desse agente em amostras fecais de bovinos leiteiros da região oeste do Paraná, Brasil

Orientador: Prof. Dr. Nelson Luis Mello FernandesCoorientadora: Profa. Dra. Adriana Fiorini RosadoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa : Curitiba, 28/01/2022Inclui referênciasResumo: O objetivo deste trabalho foi pesquisar a prevalência de Cryptosporidium spp.; determinar os principais fatores de risco associados à infecção, além de comparar protocolos de nPCR por meio da amplificação do gene 18S SSU (Small Subunit) e 28S LSU (Large Subunit), a fim de testar a especificidade e a capacidade de amplificação dos primers de cada protocolo para o diagnóstico do protozoário em amostras fecais de bovinos leiteiros da região Oeste do Paraná, Brasil. Após a realização do cálculo amostral foram coletadas 576 amostras fecais de bovinos com até 12 meses de idade, provenientes de 65 propriedades de quatro municípios da região: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina e Toledo. Em todas as propriedades foi aplicado um questionário epidemiológico a fim de detectar os principais fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. As amostras foram analisadas por meio de microscopia óptica, nested-PCR (nPCR) e sequenciamento do DNA. Das amostras analisadas, 22% (128) foram positivas na análise microscópica e a idade dos animais, área total da propriedade, sistema de produção e quantidade de animais que compõem o rebanho foram os principais fatores de risco associados à infecção. Todas as amostras positivas na análise microscópica foram submetidas a dois protocolos de nPCR. Das 126 amostras analisadas, 60,32% (76/126) foram amplificadas pelo protocolo do gene SSU, enquanto, 44,4% (55/126) das amostras amplificaram o segmento do gene LSU. Todas as amostras amplificadas foram submetidas ao sequenciamento genético e analisadas para identificação das espécies por meio da consulta ao banco de dados (BLAST®). A amplificação de cada gene possibilitou a identificação de quatro espécies, sendo estas C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) e C. muris (1) pelo amplificado do gene 28S rRNA (LSU) e C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) e C. andersoni (2), pelo amplificado do gene 18S rRNA (SSU). Embora o protocolo de nPCR (LSU) tenha apresentado maior especificidade, a análise filogenética evidenciou que o protocolo de nPCR amplificando o gene SSU permitiu maior diferenciação entre as espécies de Cryptosporidium. Desta forma o aprimoramento dos ensaios com a utilização de novos primers deve contribuir na busca de maior especificidade no diagnóstico.Abstract: The aim of this study was to investigate the prevalence of Cryptosporidium spp., to determine main risk factors associated with infection, and compare nPCR protocols by amplification of the 18S SSU (Small Subunit) and 28S LSU (Large Subunit) gene to test the specificity and amplification capacity of the primers of each protocol for the diagnosis of the protozoan parasite in fecal samples from dairy cattle in western Paraná, Brazil. After sample calculation, 576 fecal samples were collected from bovines up to 12 months old from 65 properties in four municipalities of the region: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina and Toledo. An epidemiological questionnaire was applied to all properties to detect the main risk factors associated with Cryptosporidium spp. infection. Samples were analyzed by light microscopy, nested-PCR (nPCR) and DNA sequencing. Of the samples analyzed, 22% (128) were positive in the microscopic analysis and the age of the animals, total area of the property, production system and number of animals in the herd were the main risk factors associated with infection. All positive samples in the microscopic analysis were submitted to two nPCR protocols. Of the 126 samples analyzed, 60.32% (76/126) were amplified by the SSU gene protocol, while 44.4% (55/126) of the samples amplified the LSU gene segment. All amplified samples were submitted to genetic sequencing and analyzed for species identification by consulting the database (BLAST®). The amplification of each gene allowed the identification of four species: C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) and C. muris (1) using the amplified 28S rRNA gene (LSU), and C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) and C. andersoni (2), using the amplified 18S rRNA gene (SSU). Although the nPCR protocol (LSU) showed greater specificity, phylogenetic analysis showed that the nPCR protocol amplifying the SSU gene allowed greater differentiation between Cryptosporidium species. Thus, the improvement of assays with the use of new primers should contribute to the search for greater specificity in diagnosis

Prevalence and risk factors for Leptospira spp. in dairy cattle in western Paraná, Brazil

Leptospirosis is caused by spirochete bacteria of the genus Leptospira and is considered the most widespread zoonosis worldwide. It is an important agent that causes animal production to decrease. In cattle, it affects especially the reproductive tract. The objective of this study was to determine the seroprevalence of Leptospira spp., molecularly detect the bacteria in tissues of aborted fetuses, and identify the main risk factors associated with infection in cattle in dairy farms in Western Paraná. For this purpose, 600 bovine serum samples from 60 properties and 17 bovine fetuses from nine properties were collected. Data about the properties were also collected through an epidemiological questionnaire to assess the main risk factors associated with Leptospira spp. infection. The serum samples were analyzed using microscopic agglutination test (MAT), and the fetal tissues using nested polymerase chain reaction (nested PCR). Seroprevalence of Leptospira spp. in dairy cattle in Western Paraná was 39.83% (239/600) and none of the analyzed fetuses were positive for Leptospira spp. The main risk factors identified are related to the production system, reproductive management, and the presence of dogs on the property. Leptospira spp. infection is widely spread in the cattle population in Western Paraná

OCORRÊNCIA DE PARASITAS GASTROINTESTINAIS EM CÃES E GATOS ATENDIDOS NO HOSPITAL VETERINÁRIO DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR PALOTINA

Os parasitos que mais infectam os cães e gatos são: Ancylostoma sp., Toxocara sp., Dipylidium sp., os sinais clínicos são caracterizados por diarreia, anorexia, apatia e perda de peso, acometem mais os filhotes onde o maior problema é a enterite hemorrágica aguda, podendo ser fatal (RIBEIRO, 2016). O objetivo deste estudo foi avaliar a predominância dos principais endoparasitos na região noroeste do Paraná, utilizando como foco de estudo os cães e gatos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, setor Palotina, no período entre 2019 a 2020. Utilizou-se as técnicas de flutuação simples (Willis-mollay, 1921) e centrífugo-flutuação (Sheather, 1923) para identificar ovos e oocistos dos parasitos. Foram avaliados 82 cães e 25 gatos, machos e fêmeas, com idade entre 1 mês a 15 anos, de diferentes raças, sendo mais predominante os sem raça definida. Dentre os cães, 21,95% foram positivos nos exames através de flutuação simples, destes 14,63% positivos para Ancylostoma sp., 7,32% Toxocara sp. e 2,44% Cystoisopora sp. Para os exames através de centrífugo-flutuação, 29,27% obtiveram resultados positivos, destes 14,63% positivos para Giardia sp., 7,32% Ancylostoma sp., 4,88% Toxocara sp. e 3,66% Cystoisospora sp. Durante os exames também foram encontrados oocistos de coccídeos em dois animais. Nos gatos, para a técnica de flutuação simples 12% foram positivos, destes 8% para Ancylostoma sp., 4% para Cytoisospora sp. e um animal com presença de proglotes de Dipylidium sp. nas fezes. Para centrífugo-flutuação 20% foram positivos, destes 12%  positivos para Giárdia sp., 4% Ancylostoma sp., 4% Cystoisospora sp. Outros trabalhos corroboram com estes resultados como o de Ribeiro (2016), onde foram identificados 24,91% de positividade, sendo encontrado com maior prevalência do Ancylostoma sp.; presente em 12,22%, seguido de Toxocara sp. com 7,71%. Ferraz et al. (2019) em um estudo com amostras analisadas pela técnica de centrífugo-flutuação, sendo que destas, 12,7% e 35,3% foram positivas para oocistos de Giardia sp. em cães e gatos, respectivamente. Esses gêneros tem uma grande importância na saúde pública, pois são zoonoses, como o Ancylostoma sp., que infectam pela penetração na pele (larva migrans cutânea), causando uma dermatite pruriginosa e o Toxocara sp. que causa migração em órgãos através da circulação sanguínea (larva migrans visceral), assim como o género Giardia que inclui espécies com potencial zoonótico de distribuição mundial, sendo considerado um dos parasitas mais comuns no homem e uma das principais causas de diarreia não viral em humanos e animais. Pelo fato de serem zoonoses, é necessário adotar medidas sanitárias que visem à diminuição da contaminação dos animais e do ambiente, diminuindo consequentemente a exposição a este protozoário, assim como os outros parasitos (RIBEIRO, 2016)

DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA À CARRAPATICIDAS UTILIZADOS NA REGIÃO CENTRO OESTE DO PARANÁ (Diagnostic of resistance to acaricides used in Center-West region of Paraná)

Dentre os principais vetores responsáveis por agravos à saúde animal e implicações socioeconômicas, está o Rhipicephalus Boophilus microplus, associado à transmissão de agentes da Babesiose e Anaplasmose. O método tradicional para realizar o controle desses artrópodes é baseado no uso intensivo de carrapaticidas, fator que resulta em indivíduos resistentes à determinados princípios ativos, reduzindo a efetividade dos mesmos. A resistência desenvolvida é apontada como resultado de amplificações gênicas e mutações pontuais, derivadas de uso excessivo e contínuo dos princípios ativos. Com o objetivo de avaliar a eficiência reprodutiva do carrapato, foram realizados testes in vitro com os carrapaticidas mais utilizados pelas propriedades da região Centro Oeste do Paraná. Fêmeas na fase final do engurgitamento foram encaminhadas ao Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais (DOPA) da Universidade Federal Do Paraná (UFPR) – Setor Palotina, para serem submetidas ao biocarrapaticidograma. As teleóginas foram selecionadas de acordo com seu tamanho, peso e vitalidade, lavadas em água corrente, secas e distribuídas em grupos em triplicata para cada princípio ativo analisado. Foram utilizados onze carrapaticidas com os seguintes princípios ativos: Triclorfon, Ivermectina, Amitraz, Moxidectina, Flumetrina, Fluazuron, Cipermetrina, Clorpirifós e Citronela. As teleóginas foram então submergidas em soluções preparadas de acordo com as recomendações do fabricante de cada princípio químico, durante 4 minutos e dispostas em placas de Petri que foram armazenadas em estufa B.O.D, para que se observa-se diariamente sua capacidade de oviposição e viabilidade dos ovos. Após o 14º dia as fêmeas mortas foram descartadas e sua massa de ovos pesada, retornando para a incubadora para que pudessem eclodir, sendo observados até o 31º dia. O cálculo de índice de eficiência reprodutiva foi realizado segundo Drummond et. al (1973). Nos resultados observados, a associação de diferentes drogas apresentou eficiência de 100%, entre elas: Cipermetrina, Clorpirifós e Citronela; Cipermetrina e Clorpirifós; Triclorfon e Amitraz. A Moxidectina apresentou eficiência de 99,8%, todos esses produtos poderiam ser indicados para o controle de carrapatos nessas propriedades, pois o índice de eficiência ideal é acima de 95%. Já os princípios Flumetrina, Ivermectina e Fluazuron, seriam contra indicados pois apresentaram eficiência de 92,86%, 88,98% e 6,64% respectivamente

INFECÇÃO NATURAL POR Cryptosporidium spp. EM GANSOS DOMÉSTICOS: RELATO DE CASO (Natural infection with Cryptosporidium spp. in domestic goose: case report)

Os protozoários do gênero Cryptosporidium spp. infectam uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo o homem. Três espécies são apontadas como infectantes para aves silvestres e domésticas, sendo elas, C. meleagridis, C. baileyi e C. galli. Em aves como perus, codornas, frangos e patos os dados disponíveis na literatura revelam elevada prevalência parasitando a cloaca, intestino, traqueia e pró ventrículo. A maioria das aves é assintomática, porém as que apresentam sintomatologia expressam como principal manifestação clínica a diarreia com significativa perda de peso. Em análises histopatológicas é possível verificar também a hiperplasia epitelial e dilatação de glândulas seromucosas da traqueia (Mousa,2000). O presente trabalho teve como objetivo descrever um caso de criptosporidiose em dois gansos domésticos Anser anser, provenientes de uma propriedade localizada na região Oeste do Estado do Paraná. As amostras fecais foram recebidas no Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais (DOPA) da Universidade Federal Do Paraná (UFPR) – Setor Palotina e submetidas a análises macro e microscópicas. Na análise macroscópica, não foram observadas alterações, apresentando coloração e consistência adequadas para a espécie. Foi realizada a confecção de esfregaços fecais com o conteúdo resultante da centrifugo sedimentação, posteriormente, corados pelo método de ZiehlNeelsen modificado (ORTOLANI, 2000) e analisados ao microscópio (1000x) A análise possibilitou a identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. A realização do diagnóstico coproparasitológico apresenta grande importância no monitoramento de animais domésticos e de produção, visto que os dois gansos não aparentavam manifestações clínicas. A literatura é escassa em relação a dados sobre essa espécie, entretanto, são potenciais fontes de infecção e de contaminação ambiental, atuando como reservatório do protozoário, visto que, geralmente esses Anseriformes tem convívio em meio comum a outros animais de produção. Sendo de notoriedade para saúde coletiva, a espécie C. meleagridis que parasita as espécies de aves domésticas e silvestres, apresenta potencial zoonótico. É importante o gerenciar o risco de transmissão, com a realização de diagnóstico precoce, para o monitoramento desses animais, com foco no convívio com outros reservatórios e hospedeiros, visando o controle de danos e perdas na produção animal e diminuindo o risco de infecção zoonótica

OCORRÊNCIA DE Cryptosporidium spp. NA SUINOCULTURA NO MUNICÍPIO DE PALOTINA, REGIÃO OESTE DO PARANÁ.

A criptosporidiose é uma doença de caráter zoonótico causada pelo Cryptosporidium spp., um protozoário unicelular pertencente ao filo Apicomplexa, cosmopolita com grande capacidade de disseminação principalmente por meios hídricos, tem capacidade de se desenvolver na mucosa gástrica de animais vertebrados. Em suínos os sinais clínicos se apresentam principalmente em animais jovens como diarreia não hemorrágica, pelo caráter autolimitante animais adultos podem ser hospedeiros e eliminar os oocistos com as fezes, porém sem desenvolver sinais clínicos pelo desenvolvimento de imunocompetência. A via de transmissão é fecal-oral pela eliminação de oocistos com as fezes do hospedeiro que ao esporularem são aptos a infectar outros indivíduos seja via água ou alimentos contaminados. O ciclo biológico é monoxênico iniciando-se com a ingestão de oocistos esporulados presentes no ambiente, há ruptura do oocisto após o contato com os sais biliares a nível intestinal e assim liberam-se os trofozoítos, em seguida há a invasão dos enterócitos e diferenciação em merozoíto, seguido de um ciclo de auto infecção e uma gametogonia, diferenciando-se em macrogametócitos e microgametócito, a próxima etapa é uma reprodução sexuada com  fecundação e liberação de oocistos não esporulados nas fezes do hospedeiro. Os casos de criptosporidiose estão associadas principalmente a períodos que os animais jovens são submetidos a estresse provocando imunossupressão, é comum se apresentar principalmente após a mudança de manejo, tal qual o desmame, contudo, sendo a criptosporidiose uma doença que tem a mesma apresentação clínica de enterites bacterianas supõe-se que sua ocorrência seja subestimada. Neste trabalho objetivou-se determinar qual a ocorrência do Cryptosporidium spp. em suínos provenientes da suinocultura no município de Palotina, Oeste do Paraná. Foram selecionadas 18 fêmeas gestantes, 12 leitões e 29 fêmeas acompanhadas de leitão em granjas de ciclo completo. As amostras de fezes foram coletadas e acondicionadas individualmente, seguido de análise coproparasitológica de coloração Ziehl-Neelsen modificado conforme Ortolani (2000), onde foram classificadas qualitativamente mediante a observação de oocistos. Entre as categorias analisadas foram diagnosticados positivos 8 fêmeas (44,45%), 4 leitões (33,34%) e 8 fêmeas acompanhada de leitões pré desmame (27,6%). Os resultados demonstram que há circulação ativa do protozoário nos sistemas de criação e que se perpetuam as proles subsequentes. A falta do diagnóstico adequado pode contribuir para a perpetuação do Cryptosporidium spp. nas granjas, uma vez que sinais clínicos entéricos são comumente associados a outros agentes infecciosos e são tratadas como tal pelo uso de antibióticos. Até o momento não há drogas específicas de uso veterinário para o tratamento da infecção pelo protozoário, logo a melhor maneira de controlar o agente é através de técnicas de manejo e boas práticas de criação. O controle da qualidade da água de bebida pelo monitoramento microbiológico ou pelo uso de água tratada, controle de dejetos provenientes da criação, manutenção do bem-estar dos animais para reduzir estresse, e consequentemente a minimizar imunossupressão do plantel são as melhores estratégias para reduzir a ocorrência da criptosporidiose

OCORRÊNCIA DE Cryptosporidium spp. EM SUÍNOS (Sus scrofa domesticus) CRIADOS DE MANEIRA EXTENSIVA

A criptosporidiose é uma doença parasitária, causada por coccídios do gênero Cryptosporidium, podendo acometer uma gama de animais, inclusive os suínos. A doença leva a perda do epitélio intestinal e vilosidades, resultando em diminuição na absorção de nutrientes e consequentemente, perdas na cadeia produtiva (LIMA, 2018). É uma enfermidade de caráter zoonótico, sendo ocasionada nos seres humanos principalmente pelo Cryptosporidium parvum, levando a quadros assintomáticos, ou a sintomas de diarreia, náuseas, vômito e tosse (ROSSI et al., 2014). Em pacientes imunocomprometidos, causa enterite grave, podendo ser fatal, caracterizando um grave problema de saúde pública. Essa mesma espécie é a principal responsável pela infecção em diversos animais domésticos e silvestres, demonstrando assim a importância da doença em um contexto de Saúde Única. Pesquisar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos criados de maneira extensiva no município de Toledo, região Oeste do estado do Paraná, Brasil. As coletas foram realizadas em duas propriedades rurais distintas, localizadas no município de Toledo. Ambas as propriedades possuíam instalações simples, ausência de manejo antiparasitário e ausência de tratamento dos excrementos dos animais. Dez amostras fecais foram colhidas diretamente da ampola retal dos animais, sendo seis amostras da primeira propriedade e quatro da segunda propriedade. As amostras foram armazenadas em frascos com tampa rosca, refrigeradas e analisadas em até 48 horas. Para a detecção dos oocistos do protozoário, foi utilizada a técnica de Ziehl-Neelsen modificado. Dos dez animais testados, apenas dois demonstraram positividade para o protozoário (20%) na técnica utilizada. Ambos os animais positivos eram oriundos da primeira propriedade. A presença do protozoário nos animais nas propriedades avaliadas neste estudo indica um risco de contaminação de animais e seres humanos que convivem e manejam os mesmos, bem como, uma possível contaminação ambiental do solo e afluentes. É importante recomendar nestes casos, a adoção de manejo antiparasitário nos animais e destinação correta dos excrementos, de modo a objetificar a eliminação da infecção parasitária nos animais. Diminuindo dessa forma, as chances de infecção de outros animais, do ambiente e do homem

INFECÇÃO NATURAL POR Cryptosporidium parvum: RELATO DE CASO (Natural infection with Cryptosporidium parvum: case report)

A diarreia neonatal bovina é uma doença de origem multifatorial e entre os agentes envolvidos está o Cryptosporidium parvum, que ganha destaque por ser o principal protozoário responsável por ocasionar diarreia em bezerros neonatos e possuir elevado potencial zoonótico. O presente trabalho teve como objetivo, descrever um caso de infecção natural por C. parvum em um bovino diagnosticado no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) e no Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais (DOPA) da Universidade Federal do Paraná (UFPR) – Setor Palotina. Foi atendido no Hospital Veterinário da UFPR, um bovino, fêmea, Girolando, com 10 dias de vida, e conforme o histórico, o animal foi adquirido de outra propriedade que realizava a colostragem de forma inadequada, e desde a aquisição, o animal começou a apresentar manifestações clínicas como prostração e diarreia amarelada e fétida. Realizou-se tratamento, porém sem sucesso, e o animal foi a óbito, sendo encaminhado para o LPV para a autópsia. No exame macroscópico, observou-se baixo escore corporal com discreta deposição de tecido adiposo em subcutâneo e mesentério, a mucosa oral e ocular estavam levemente pálidas e no intestino, notou-se leve distensão por conteúdo gasoso e áreas multifocais com leve quantidade de conteúdo avermelhado líquido, por vezes, amarelado e fétido. Na análise histopatológica, notou-se nos no ápice das vilosidades, a presença leve de estruturas multifocais, arredondadas, eosinofílicas, medindo entre 1 a 2µm, compatíveis com Cryptosporidium spp. Parte do conteúdo fecal foi remetido ao DOPA, onde realizou-se a análise microscópica e molecular. Para a análise microscópica, foi confeccionado esfregaço fecal com o conteúdo resultante da centrifugo sedimentação, posteriormente, corado pelo método de Ziehl-Neelsen modificado (ORTOLANI, 2000). A análise confirmou a identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. Após a análise microscópica a amostra foi submetida a clarificação, extração de DNA e nested-PCR (nPCR) (XIAO et al. 1999). Para a realização da PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) e nPCR, uma alíquota da amostra foi utilizada para a extração de DNA utilizando o Kit ChargeSwitch® gDNA Mini Tissue (Invitrogen). A região 18 SSU rRNA foi selecionada como sequência alvo para amplificação de DNA, sendo que, o amplicon esperado era de 826-864pb. A reação foi realizada com o volume final de 25μL e o produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,6%. Com o intuito de identificar a espécie envolvida na infecção, após a amostra apresentar resultado positivo na técnica de nPCR, esta foi encaminhada para o sequenciamento e, após a análise da sequência de dados obtida, foi determinado que Cryptosporidium parvum era a espécie envolvida neste caso. Desta forma, o monitoramento dos animais para a obtenção do diagnóstico precoce é de suma importância para evitar as possíveis perdas na produção animal e gerenciar o risco da transmissão para seres humanos

INFECÇÃO PARASITÁRIA PULMONAR EM Puma yagourandi: RELATO DE CASO (Pulmonary parasitic infection in Puma yagourandi: case report)

Aelurostrongylus abstrusus é um nematódeo pouco diagnosticado na rotina veterinária, onde os parasitas adultos têm como localização as vias aéreas de felinos e a postura de ovos pode acontecer no parênquima pulmonar ou em pequenos vasos alveolares, os quais eclodem as larvas de primeiro estágio (L1), que ao serem deglutidas são eliminadas com as fezes. No ambiente, as larvas encontram os hospedeiros intermediários, podendo ainda se disseminar por diversos hospedeiros paratênicos. Os felinos se infectam através da ingestão dos moluscos contendo as larvas infectantes (L3) ou ingerindo os hospedeiros paratênicos, e após a digestão, as larvas atingem os pulmões migrando pelo sistema circulatório e linfático, onde evoluem para adultos. A maioria das infecções são assintomáticas, entretanto, em casos mais graves os animais podem desenvolver complicações, como pneumonia, efusão pleural, piotórax, entre outras, podendo ser fatais. O presente trabalho teve por objetivo descrever as alterações de um caso de infecção natural por A. abstrusus em gato mourisco (Puma yagourandi), diagnosticado pelos Laboratórios de Doenças Parasitárias dos Animais (DOPA) e Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal do Paraná (UFPR), Setor Palotina. O felino que havia sido vítima de atropelamento, chegou ao Hospital Veterinário da UFPR já morto sendo prontamente encaminhado a necropsia. Na análise macroscópica, o pulmão apresentava áreas multifocais a coalescentes moderadamente avermelhadas e hipocrepitantes, além de presença multifocal de estruturas parasitárias ao corte. Na análise histopatológica, foi observada uma pneumonia granulomatosa multifocal moderada, composta por linfócitos, macrófagos, plasmócitos e células gigantes do tipo Langerhans. No lúmen bronquial, no centro do infiltrado, notou-se a presença de um parasita de forma arredondada, de aproximadamente 350 µm de diâmetro, com cavidade celomática, trato digestório musculoso e aparelho reprodutivo bem evidente, com múltiplos ovos larvados em seu interior, camada muscular delgada e cordões laterais paralelos evidentes (compatíveis com A. abstrusus). No lúmen dos bronquíolos havia grande quantidade de ovos em diferentes estágios de desenvolvimento larval, medindo de 80 a 150 µm de diâmetro. O epitélio bronquial e a camada muscular das arteríolas estavam moderadamente espessados com aumento no número de camadas celulares (hiperplasia) e no lúmen dos alvéolos, havia moderada quantidade de macrófagos espumosos. Durante a necropsia, foram coletados espécimes de parasitas provenientes do pulmão, assim como, amostra de lavado traqueobronquioalveolar, ambas foram encaminhadas ao DOPA. As amostras foram analisadas através do método parasitológico direto, com auxílio do microscópio de luz, estereomicroscópico e chaves para a identificação de nematódeos (VICENTE et al, 1997). Na amostra de lavado traqueobronquioalveolar, foi possível visualizar ovos larvados e larvas que foram identificadas e classificadas como A. abstrusus, assim como os espécimes adultos. A aelurostrongilose felina é uma doença negligenciada, subdiagnosticada e, grande parte das infecções são assintomáticas e acabam sendo um achado anatomopatológico, como no presente estudo. Desta forma, torna-se importante realizar o acompanhamento coproparasitológico dos felinos para realização do diagnóstico precoce e diagnóstico diferencial para outras infecções respiratórias como Trogostrongylus brevior, Capillaria aerophila e Angyostrongylus vasorum (que apresenta potencial zoonótico)

Prevalência e fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. e comparação de protocolos de nPCR para a detecção desse agente em amostras fecais de bovinos leiteiros da região oeste do Paraná, Brasil

Orientador: Prof. Dr. Nelson Luis Mello FernandesCoorientadora: Profa. Dra. Adriana Fiorini RosadoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa : Curitiba, 28/01/2022Inclui referênciasResumo: O objetivo deste trabalho foi pesquisar a prevalência de Cryptosporidium spp.; determinar os principais fatores de risco associados à infecção, além de comparar protocolos de nPCR por meio da amplificação do gene 18S SSU (Small Subunit) e 28S LSU (Large Subunit), a fim de testar a especificidade e a capacidade de amplificação dos primers de cada protocolo para o diagnóstico do protozoário em amostras fecais de bovinos leiteiros da região Oeste do Paraná, Brasil. Após a realização do cálculo amostral foram coletadas 576 amostras fecais de bovinos com até 12 meses de idade, provenientes de 65 propriedades de quatro municípios da região: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina e Toledo. Em todas as propriedades foi aplicado um questionário epidemiológico a fim de detectar os principais fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. As amostras foram analisadas por meio de microscopia óptica, nested-PCR (nPCR) e sequenciamento do DNA. Das amostras analisadas, 22% (128) foram positivas na análise microscópica e a idade dos animais, área total da propriedade, sistema de produção e quantidade de animais que compõem o rebanho foram os principais fatores de risco associados à infecção. Todas as amostras positivas na análise microscópica foram submetidas a dois protocolos de nPCR. Das 126 amostras analisadas, 60,32% (76/126) foram amplificadas pelo protocolo do gene SSU, enquanto, 44,4% (55/126) das amostras amplificaram o segmento do gene LSU. Todas as amostras amplificadas foram submetidas ao sequenciamento genético e analisadas para identificação das espécies por meio da consulta ao banco de dados (BLAST®). A amplificação de cada gene possibilitou a identificação de quatro espécies, sendo estas C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) e C. muris (1) pelo amplificado do gene 28S rRNA (LSU) e C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) e C. andersoni (2), pelo amplificado do gene 18S rRNA (SSU). Embora o protocolo de nPCR (LSU) tenha apresentado maior especificidade, a análise filogenética evidenciou que o protocolo de nPCR amplificando o gene SSU permitiu maior diferenciação entre as espécies de Cryptosporidium. Desta forma o aprimoramento dos ensaios com a utilização de novos primers deve contribuir na busca de maior especificidade no diagnóstico.Abstract: The aim of this study was to investigate the prevalence of Cryptosporidium spp., to determine main risk factors associated with infection, and compare nPCR protocols by amplification of the 18S SSU (Small Subunit) and 28S LSU (Large Subunit) gene to test the specificity and amplification capacity of the primers of each protocol for the diagnosis of the protozoan parasite in fecal samples from dairy cattle in western Paraná, Brazil. After sample calculation, 576 fecal samples were collected from bovines up to 12 months old from 65 properties in four municipalities of the region: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina and Toledo. An epidemiological questionnaire was applied to all properties to detect the main risk factors associated with Cryptosporidium spp. infection. Samples were analyzed by light microscopy, nested-PCR (nPCR) and DNA sequencing. Of the samples analyzed, 22% (128) were positive in the microscopic analysis and the age of the animals, total area of the property, production system and number of animals in the herd were the main risk factors associated with infection. All positive samples in the microscopic analysis were submitted to two nPCR protocols. Of the 126 samples analyzed, 60.32% (76/126) were amplified by the SSU gene protocol, while 44.4% (55/126) of the samples amplified the LSU gene segment. All amplified samples were submitted to genetic sequencing and analyzed for species identification by consulting the database (BLAST®). The amplification of each gene allowed the identification of four species: C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) and C. muris (1) using the amplified 28S rRNA gene (LSU), and C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) and C. andersoni (2), using the amplified 18S rRNA gene (SSU). Although the nPCR protocol (LSU) showed greater specificity, phylogenetic analysis showed that the nPCR protocol amplifying the SSU gene allowed greater differentiation between Cryptosporidium species. Thus, the improvement of assays with the use of new primers should contribute to the search for greater specificity in diagnosis