Prevalência e fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. e comparação de protocolos de nPCR para a detecção desse agente em amostras fecais de bovinos leiteiros da região oeste do Paraná, Brasil

Abstract

Orientador: Prof. Dr. Nelson Luis Mello FernandesCoorientadora: Profa. Dra. Adriana Fiorini RosadoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa : Curitiba, 28/01/2022Inclui referênciasResumo: O objetivo deste trabalho foi pesquisar a prevalência de Cryptosporidium spp.; determinar os principais fatores de risco associados à infecção, além de comparar protocolos de nPCR por meio da amplificação do gene 18S SSU (Small Subunit) e 28S LSU (Large Subunit), a fim de testar a especificidade e a capacidade de amplificação dos primers de cada protocolo para o diagnóstico do protozoário em amostras fecais de bovinos leiteiros da região Oeste do Paraná, Brasil. Após a realização do cálculo amostral foram coletadas 576 amostras fecais de bovinos com até 12 meses de idade, provenientes de 65 propriedades de quatro municípios da região: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina e Toledo. Em todas as propriedades foi aplicado um questionário epidemiológico a fim de detectar os principais fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium spp. As amostras foram analisadas por meio de microscopia óptica, nested-PCR (nPCR) e sequenciamento do DNA. Das amostras analisadas, 22% (128) foram positivas na análise microscópica e a idade dos animais, área total da propriedade, sistema de produção e quantidade de animais que compõem o rebanho foram os principais fatores de risco associados à infecção. Todas as amostras positivas na análise microscópica foram submetidas a dois protocolos de nPCR. Das 126 amostras analisadas, 60,32% (76/126) foram amplificadas pelo protocolo do gene SSU, enquanto, 44,4% (55/126) das amostras amplificaram o segmento do gene LSU. Todas as amostras amplificadas foram submetidas ao sequenciamento genético e analisadas para identificação das espécies por meio da consulta ao banco de dados (BLAST®). A amplificação de cada gene possibilitou a identificação de quatro espécies, sendo estas C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) e C. muris (1) pelo amplificado do gene 28S rRNA (LSU) e C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) e C. andersoni (2), pelo amplificado do gene 18S rRNA (SSU). Embora o protocolo de nPCR (LSU) tenha apresentado maior especificidade, a análise filogenética evidenciou que o protocolo de nPCR amplificando o gene SSU permitiu maior diferenciação entre as espécies de Cryptosporidium. Desta forma o aprimoramento dos ensaios com a utilização de novos primers deve contribuir na busca de maior especificidade no diagnóstico.Abstract: The aim of this study was to investigate the prevalence of Cryptosporidium spp., to determine main risk factors associated with infection, and compare nPCR protocols by amplification of the 18S SSU (Small Subunit) and 28S LSU (Large Subunit) gene to test the specificity and amplification capacity of the primers of each protocol for the diagnosis of the protozoan parasite in fecal samples from dairy cattle in western Paraná, Brazil. After sample calculation, 576 fecal samples were collected from bovines up to 12 months old from 65 properties in four municipalities of the region: Cascavel, Marechal Cândido Rondon, Palotina and Toledo. An epidemiological questionnaire was applied to all properties to detect the main risk factors associated with Cryptosporidium spp. infection. Samples were analyzed by light microscopy, nested-PCR (nPCR) and DNA sequencing. Of the samples analyzed, 22% (128) were positive in the microscopic analysis and the age of the animals, total area of the property, production system and number of animals in the herd were the main risk factors associated with infection. All positive samples in the microscopic analysis were submitted to two nPCR protocols. Of the 126 samples analyzed, 60.32% (76/126) were amplified by the SSU gene protocol, while 44.4% (55/126) of the samples amplified the LSU gene segment. All amplified samples were submitted to genetic sequencing and analyzed for species identification by consulting the database (BLAST®). The amplification of each gene allowed the identification of four species: C. parvum (41), C. bovis (8), C. ryanae (5) and C. muris (1) using the amplified 28S rRNA gene (LSU), and C. parvum (34), C. bovis (8), C. ryanae (4) and C. andersoni (2), using the amplified 18S rRNA gene (SSU). Although the nPCR protocol (LSU) showed greater specificity, phylogenetic analysis showed that the nPCR protocol amplifying the SSU gene allowed greater differentiation between Cryptosporidium species. Thus, the improvement of assays with the use of new primers should contribute to the search for greater specificity in diagnosis