Star forming regions of the southern galaxy

A catalog of southern dust cloud properties is being compiled to aid in the planning and analysis of radio spectral line surveys in the southern hemisphere. Ultimately, images of dust temperature and column density will be produced. For the interim, a list of the 60 and 100 micron fluxes was prepared for the cores and adjacent backgrounds of 65 prominent dust clouds. Dust temperatures and column densities were derived

Discovery and characterizatopn of small molecular weight metallocarboxypeptidase inhibitors

Descripció del recurs: el 02 de novembre de 2010Las hidrolasas son enzimas que catalizan la ruptura del enlace amida o peptódico, y por lo tanto son denominadas también proteasas o peptidasas. Las proteasas constituyen cerca del 2 % del genoma humano, lo que representa unos 600 productos génicos. De acuerdo con el residuo catalóticamente activo, existen seis grandes grupos de peptidasas. En este trabajo nos centraremos en la familia M14 de peptidasas, también denominadas metalocarboxipeptidasas (CPs) debido a que su actividad catalótica reside en el ion zinc presente en el sitio activo de la enzima. En el genoma humano, se han identificado al menos 26 genes que codifican carboxipeptidasas. Las peptidasas de la familia M14 que actúan en el tracto gastrointestinal son las principales metaloproteasas responsables de la obtención de aminoácidos libres de la proteína de la dieta. En otros compartimientos corporales, las CPs pueden llevar a cabo tareas especializadas y altamente reguladas como ser la maduración de neuropéptidos, citokinas y hormonas peptódicas. En algunos casos, una actividad catalótica fuera de control puede conducir a enfermedades. Cada vez existe una mayor evidencia experimental que demuestra la actividad carboxipeptidasa en procesos como la pancreatitis aguda, la diabetes, la inflamación, la fibrinólisis y el cáncer. A pesar de ciertos avances en algunos aspectos, la actividad específica de las CPs es pobremente conocida. Además, las carboxipeptidasas son blancos terapéuticos interesantes para el desarrollo de fármacos, y por lo tanto se ha decidido emplear una aproximación multi-disciplinaria para la identificación y caracterización de nuevas moléculas de bajo peso molecular capaces de interferir la actividad carboxipeptidasa. Así, en este trabajo se han combinado modernas herramientas computacionales, screening in vitro, modelado molecular y cristalografía de rayos X con el fin de obtener nuevas entidades quφmicas como base para el desarrollo de fármacos. Con base en herramientas computacionales, aplicando el método de Optimal Docking Areaö, se han caracterizado sitios de unión proteína-proteína y proteína-ligando en la superficie de las peptidasas de la familia M14. A partir de aquí, se identificó una nueva clase de compuestos químicos capaces de explotar las diferencias existentes entre enzimas de la familia por unión a regiones hidrofóbicas. Otros inhibidores fueron identificados mediante un screening in silico de grandes colecciones de compuestos. Ensayos in vitro demostraron que los compuestos líderes inhibieron de manera potente a las carboxipeptidasas blanco con otras características interesantes como la posibilidad de coordinación del ion zinc catalítico por intermedio de un anillo oxadiazol. A través de una colaboración con el Departamento de Química Orgánica se obtuvieron y caracterizaron nuevos compuestos químicos con conectividades atómicas novedosas que, inesperadamente, demostraron ser potentes inhibidores de carboxipeptidasas. Una clase adicional de molécula de bajo peso molecular caracterizada corresponde a inhibidores que se unen covalentemente al enzima blanco. En este caso, se logró obtener la estructura tridimensional del complejo a resolución atómica mediante cristalografφa de rayos X, lo que ha permitido el dise±o basado en la estructura de una nueva generación de compuestos. Basados en otros datos de cristalografía de rayos X y análisis computacional, se ha revisado y ampliado el mecanismo de acción catalítica de las peptidasas de la familia M14 a partir de una nueva forma cristalina de CPB a alta resolución. En conjunto, nuestro trabajo ha permitido la obtención de nuevas moléculas líderes de bajo peso molecular que podrían servir como base para futuros desarrollos en el diseño de fármacos y agentes de diagnóstico o imaginería dirigidos a metalocarboxipeptidasas fisiológicamente activas.Hydrolases are enzymes catalyzing the breakdown of the amide or peptide bond, and are therefore called proteases or peptidases as well. In the human genome, proteases made up about 2% of the genome, or about 600 gene products. There are six major groups of peptidases according to the catalytic residue. In our work we focused on the M14 family of peptidases, also called metallocarboxypeptidases (CPs) because of their catalytic activity hinges on the zinc ion present in the active site of the enzyme. In the human genome there are identified at least 26 genes encoding for CPs. M14 peptidases in the gastrointestinal tract are the main metalloproteases responsible of the liberation of free aminoacids from the protein content of the diet. In other compartments of the body, CPs may perform specialized and tightly controlled tasks such as neuropeptide, cytokine and hormone maturation. In some instances an imbalance in their activity leads to disease states in man. Increasing evidence shows carboxypeptidase involvement in acute pancreatitis, diabetes, inflammation, fibrinolysis and cancer. Although some aspects have become clearer, much of their activity remain poorly understood. Besides, carboxypeptidases are interesting targets for drug development, and therefore we pursued a multidisciplinary approach to identify and characterize novel small molecular weight compounds able to interfere carboxypeptidase activity. In this work we combined modern computational tools, in vitro screening, molecular modelling and X-ray crystallography to obtain new chemical entities useful as scaffolds for drug design. Based on a bioinformatics tools, the Optimal Docking Area method, we identified protein-protein and protein-ligand binding sites over the surface of M14 peptidases. This knowledge was employed to find out a new class of small molecular weight inhibitors which exploit the differential binding provided by hydrophobic patches. A further class of inhibitors was identified from in silico screening of collections of compounds. In vitro analysis revealed that the leads were potent inhibitors against the target proteases with interesting features like an oxadiazole zinc-chelating moiety. Compounds obtained from the Organic Chemistry Department were also screened, and unexpectedly, afforded some good inhibitors with unprecedented atomic bonding. One further class involved inhibitors that attach covalently to the target enzyme. In this case the structure of the complex obtained at high resolution by X-ray crystallography allowed the structure-guided design of new generation of compounds. The catalytic mechanism of M14 peptidases was also revisited based on our crystallographic and computational analysis of a new CPB crystal form at high resolution. Overall, our study provided new lead small molecular weight inhibitors which can be the foundation for further developments in the design of drugs and bioimaging or diagnostic agents targeted to physiologically-relevant metallocarboxypeptidases

Rastres genètics de colls d'ampolla en poblacions de llop europees

El llop ibèric ha estat en el llindar de l'extinció, potser molt més a prop del que inicialment es va pensar. Investigadors de la UAB i de la UPF-CSIC han realitzat un estudi comparatiu entre el llop ibèric i el llop rus i han trobat que o bé es van subestimar els efectes genètics dels delmes de la població del llop ibèric (anomenats colls d'ampolla) durant el segle passat, o bé hi ha una sobreestimació del nombre actual de llops a la Península Ibèrica. L'estudi posa en relleu la necessitat d'assegurar el futur del llop mitjançant el creixement constant de les poblacions, sempre que sigui possible, així com la importància d'evitar la fragmentació poblacional i del territori.El lobo ibérico ha estado en el umbral de la extinción, quizás mucho más cerca de lo que inicialmente se pensó. Investigadores de la UAB y de la UPF-CSIC han realizado un estudio comparativo entre el lobo ibérico y el lobo ruso y han hallado que o bien se subestimaron los efectos genéticos de los diezmos de la población del lobo ibérico (llamados cuellos de botella) durante el siglo pasado, o bien hay una sobreestimación del número actual de lobos en la Península Ibérica. El estudio pone de relieve la necesidad de asegurar el futuro del lobo mediante el crecimiento constante de las poblaciones, siempre que sea posible, así como la importancia de evitar la fragmentación poblacional y del territorio

Descriuen una proteïna clau per al desenvolupament del sistema nerviós

Investigadors de l'Institut de Recerca de l'Hospital de la Vall d'Hebron i de la UAB han descrit una nova funció de la proteïna FLIP-L, clau per al desenvolupament del sistema nerviós. Aquesta proteïna pot interrompre l'apoptosi cel·lular, la mort programada a les cèl·lules. S'expressa precoçment durant la formació del sistema nerviós, disminuint la seva concentració progressivament al llarg del desenvolupament embrionari. El seu estudi pot suposar un gran avenç contra malalties com el Parkinson o l'Alzheimer.Investigadores del Instituto de Investigación del Hospital de la Vall d'Hebron y de la UAB han descrito una nueva función de la proteína FLIP-L, clave para el desarrollo del sistema nervioso. Esta proteína puede interrumpir la apoptosis celular, la muerte programada en las células. Se expresa precozmente durante la formación del sistema nervioso, disminuyendo su concentración progresivamente a lo largo del desarrollo embrionario. Su estudio puede suponer un gran avance contra enfermedades como el Parkinson o el Alzheimer

Metabolismo y funcionalidad de HDL en un modelo murino (db/db) de diabesidad y efectos de la sobreexpresión de apolipoproteína A-I humana /

Numerosos estudios experimentales revelan una relación causal entre HDL y el riesgo de arteriosclerosis; de ahí, el interés en el desarrollo de diferentes estrategias basadas en la hiperexpresión de su principal apolipoproteína, (apo)A-I, para su prevención y tratamiento. Datos previos en humanos y modelos experimentales sugieren que las propiedades antiaterogénicas de las HDL se encuentran alteradas en obesidad y diabetes. El presente trabajo se centró en el estudio de las propiedades antiaterogénicas más importantes atribuidas a las HDL (ie, transporte reverso de colesterol específico de macrófagos in vivo -TRC-m-, y actividad antioxidante y antiinflamatoria) en un modelo animal de obesidad, el ratón db/db, y el impacto de la sobreexpresión de apoA-I humana (hA-I) sobre dichas propiedades. Los ratones db/db presentaron un aumento en los niveles plasmáticos de colesterol, principalmente debido a su aumento en HDL. El análisis cuantitativo y cualitativo de HDL reveló alteraciones en su tamaño y composición, y su catabolismo se encontró disminuido. Los estudios metabólicos en ratones db/db también revelaron una acumulación hepática del colesterol transportado por HDL y una eliminación de colesterol fecal disminuida, lo que se asoció con una disminución en la expresión génica de los transportadores de colesterol (ie, Abcg5 y Abcg8) y de ácidos biliares (ie, Bsep). Además de Abcg5 y Abcg8, la expresión de otras dianas moleculares de LXR también se encontró disminuida, sugiriendo que esta vía de señalización estaría comprometida en estos ratones. El análisis del TRC-m arrojó resultados similares a los alcanzados en la evaluación del metabolismo de HDL. La activación de LXR contribuyó a rescatar parcialmente el TRC-m en los ratones db/db, en concomitancia con un aumento en la expresión hepática de Abcg5 y Abcg8. Otras de las funciones ateroprotectoras más importantes de HDL analizadas ex vivo (ie, capacidad antioxidante y antiinflamatoria) también se encontraron alteradas en estos ratones. La sobreexpresión de hA-I en ratones transgénicos y en db/db (ie, db/db-hA-I) resultó en un aumento de los niveles plasmáticos de HDL y en cambios en su composición. También aumentó el TRC-m, en parte debido a un aumento combinado en la capacidad del plasma en promover el eflujo de colesterol desde macrófagos y su eliminación fecal, lo que coincidió con un restablecimiento de la expresión génica de los transportadores Abcg5 y Abcg8, principalmente involucrados en regular el tráfico de colesterol de hígado a heces. Sin embargo, dicho aumento no previno, incluso aumentó la esteatosis hepática en ratones db/db-hA-I en comparación con los ratones db/db. Por otro lado, aunque no se observaron cambios en la capacidad de HDL de los ratones db/db-hA-I de proteger de la oxidación a LDL, la resistencia de sus HDL a ser oxidadas sí aumentó, así como su capacidad antiinflamatoria. En conclusión, las principales propiedades funcionales ateroprotectoras de las HDL se encontraron comprometidas en el ratón db/db, principalmente debido a alteraciones en su composición y metabolismo. Aunque la presencia de cantidades elevadas de hA-I en este modelo experimental de diabesidad resultó en una mejora del TRC-m y en la capacidad antiinflamatoria de sus HDL, ello también se asoció al empeoramiento de otras alteraciones patológicas ya existentes, como la esteatosis hepática.A large body of experimental evidences reveals a causal inverse relationship between HDL and the risk of atherosclerostic vascular diseases. The demonstration that HDL and, its main apolipoprotein, apoA-I, exhibit favorable antiatherogenic actions has led to the development of different HDL-based strategies, such as that provided by the hyperexpression of apoA-I, for the prevention and treatment of atherosclerosis. Previous data in both humans and experimental models suggest that the antiatherogenic properties of HDL are impaired in obesity and diabetes. In this context, the main aims of the present work were to evaluate the most important anti-atherogenic properties attributed to HDL (ie, macrophage-specific reverse cholesterol transport in vivo -TRC-m-, and its anti-oxidant and anti-inflammatory activities ex vivo) in an animal model of diabesity, the db/db mouse, and the impact of overexpression of human apoA-I (hA-I) on these properties. The db/db mice showed an increase in their plasma levels of cholesterol, mainly attributed to elevated plasma levels of HDL. The quantitative and qualitative analysis of these lipoproteins revealed alterations in both their size and composition. The HDL from db/db were poorly catabolized compared with those from control mice. Metabolic studies also revealed that the HDL-related radiolabel was found to accumulate in the liver of the db/db mice, whereas the radiolabel reaching the feces was reduced compared with that of control mice. Notably, the latter finding was found further associated with a decreased expression in both the Abcg5 and Abcg8, and Bsep involved in the cholesterol and bile acid trafficking into bile, respectively. In addition to Abcg5 and Abcg8, the expression of other molecular targets of LXR was also reduced in the liver of db/db mice, suggesting that this signaling pathway could be compromised in these mice. Similar data were obtained after the evaluation of TRC-m in this model. Induction of LXR partially rescued the TRC-m in db/db mice, being the latter associated with a concomitant increase in the hepatic expression of Abcg5 and Abcg8. The other two most important atheroprotective functions attributed to HDL (ie, its anti-oxidant and anti-inflammatory capacity) were also found compromised in the db/db mice. The overexpression of hA-I in transgenic and in db/db mice (ie, db/db-hA-I) produced a striking elevation in the plasma levels of HDL in this model and in changes in the composition of their HDL. The TRC-m was also stimulated in this animal model, partly due to the combined increase in the capacity of plasma to promote cholesterol efflux from macrophages and cholesterol trafficking from the liver to feces, which coincided with a restoration of the hepatic expression of Abcg5 and Abcg8, two transporters mainly involved in modulating this process. However, such increase did not prevent, even exacerbated the hepatic steatosis in db/db-hA-I compared with db/db mice. Furthermore, the overexpression of hA-I in the db/db mice did not significantly improve the ability of their HDL to prevent LDL oxidation ex vivo, despite being less prone to oxidation than those from db/db mice, but significantly enhanced their anti-inflammatory capacity, being the latter mainly attributed to the presence of hA-I in their HDL. In conclusion, the main atheroprotective properties of HDL were hampered in the db/db mice, primarily due to alterations in their composition and metabolism. Furthermore, although the presence of hA-I in this experimental model of diabesity displayed a favorable impact on the TRC-m and improved the anti-inflammatory properties of their HDL, it also worsened other existing pathological alterations, such as hepatic steatosis

Valoración de la exposición pasiva a sustancias de abuso en población pediátrica mediante el uso de matrices biológicas no convencionales

El abuso de sustancias en los países occidentales ha acontecido un problema de salud pública. Lamentablemente, estas sustancias de abuso son además una carga para las personas que no las consumen, por ello, la población pediátrica es especialmente vulnerable. Desde la década de los ochenta, la eventual presencia y disposición de una sustancia de abuso en el organismo y su correlación con efectos clínicos y/o subjetivos ha sido evaluada mediante el análisis de plasma u orina. Sin embargo, realizar estas determinaciones en fluidos y matrices biológicas diferentes a la sangre y la orina (de aquí su nombre "fluidos y matrices no convencionales") resultan ser mucho más atractivas. Valoración de la exposición a sustancias de abuso durante el inicio de la gestación mediante el análisis de placenta. La determinación de sustancias de abuso en muestras de placenta obtenidas cómo material de descarte en mujeres que interrumpieron voluntariamente su embarazo sirvió para confirmar la transmisión de las drogas de abuso al feto durante el primer trimestre de gestación. Exposición pasiva a drogas de abuso mediante el análisis de cabello. En este trabajo se ha utilizado el análisis de cabello con el fin de esclarecer la prevalencia insospechada de exposición a cocaína en niños de edad preescolar visitados en un servicio de urgencias pediátrico sin presentar signos indicativos de una exposición a sustancias de abuso. Las muestras de cabello de 21 niños (23.3%) fueron positivas para cocaína (COC) (rango de concentración: 0,3 - 5.96 ng/mg cabello) y además una de ellas fue positiva para 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) y otra para opiáceos. En el 88% de los casos positivos, también se halló la presencia de COC en la muestra de cabello del padre que acompañaba a su hijo a la visita hospitalaria. En vista de los resultados obtenidos, abogamos por el cribado mediante el análisis de cabello para esclarecer la presencia de COC y otras sustancias de abuso en niños pertenecientes a ambientes de elevado riesgo de exposición a sustancias de abuso. Valoración de la exposición pasiva a humo de tabaco mediante el análisis de dientes de leche. El uso de los dientes de leche, los cuales empiezan a formarse en la etapa prenatal puede informar acerca de la acumulación de nicotina (NIC) y otros metabolitos durante toda la infancia. Por ello, se ha desarrollado una metodología basada en la LC-MS-MS con el fin de poder detectar cantidades ínfimas de estos metabolitos en dientes de leche. Los resultados en 64 muestras de dientes mostraron que tan solo la NIC era capaz de discriminar estadísticamente entre los niños expuestos ambientalmente al humo de tabaco. Estos prometedores resultados abogan por la inclusión de la monitorización de los niveles de NIC en dientes en estudios epidemiológicos con el fin de categorizar la exposición acumulativa al humo de tabaco durante toda la infancia. Discusión y conclusiones. Esta tesis pone de manifiesto la alta exposición pasiva e insospechada a las principales sustancias de abuso tanto legal (tabaco) como ilegal (cocaína) gracias al empleo de biomarcadores detectados en matrices no convencionales como la placenta, el pelo y los dientes de leche en niños diferentes etapas de la infancia. En conclusión, con el fin de detectar la exposición a sustancias de abuso en las diferentes etapas de la infancia (incluyendo la etapa prenatal y la etapa postnatal) es recomendable utilizar diferentes matrices no convencionales (o alternativas) con el fin de minimizar la invasividad en la recogida de las muestras en comparación con las matrices utilizadas tradicionalmente.The substance abuse in developed countries has become a public health problem. Unfortunately, these substances of abuse are also a burden for people who do not consume; therefore, the pediatric population is especially vulnerable. Since the eighties, the possible presence of a substance abuse in the body and its correlation with clinical effects and / or subjective effects has been assessed analyzing plasma or urine. However, the determination of this substances in biological fluids and matrices different than blood and urine (hence the name "non-conventional fluids and matrices") are much more attractive. For the non-invasiveness in the collection of the samples and the fact that can provide much more information about the exposure, biological matrices such as placenta, hair and teeth, are good matrices to assess chronic exposure to drugs of abuse during different stages of the childhood. Assessment of the exposure to substances of abuse during early gestation by analysis of the placenta. The determination of drugs of abuse in samples of placenta obtained as discard material in women who voluntarily terminated their pregnancy served to confirm the transmission of drugs of abuse to the fetus during the first trimester of gestation. Passive exposure to drugs of abuse using hair analysis. In this work we used hair analysis to clarify the unexpected prevalence of cocaine exposure in preschool children visited in the pediatric emergency department with no signs indicative of exposure to substances of abuse. Hair samples from 21 children (23.3%) were positive for cocaine (concentration range: 0.3 - 5.96 ng / mg of hair) and also one of them was positive for MDMA and another one for opiates. In 88% of positive cases, also found the presence of cocaine in the hair sample of the parent who accompanied his son to the hospital visit. In view of these results, we advocate screening by hair analysis to ascertain the presence of cocaine and other substances of abuse in children from high-risk environments of exposure to substances of abuse. Assessment of passive exposure to tobacco smoke by the analysis of dedicious teeth. We used decidious teeth, which begin to form in the prenatal stage, to report the accumulation of nicotine (NIC) and other metabolites throughout childhood. Therefore, we have developed a methodology based on LC-MS-MS in order to detect minute amounts of these metabolites in decidious teeth. The results obtained in 64 samples of teeth showed that only the NIC was able to discriminate statistically among children exposed to tobacco snuff environmentally. These promising results argue for the inclusion of monitoring NIC levels in teeth in epidemiological studies to categorize cumulative exposure to passive smoke throughout childhood. Discussion and conclusions. This thesis reveals the unsuspected high passive exposures to the main substances of abuse both legal (tobacco) and illegal (cocaine) by the use of biomarkers detected in non-conventional matrices such as the placenta, hair and teeth in children different stages of childhood. In conclusion, in order to detect exposure to substances of abuse in different stages of childhood (including prenatal and postnatal) is recommended to use different non-conventional matrices (or alternatives) in order to minimize the invasiveness collecting samples as compared with traditionally used matrices

Estimació de la incertesa de mesura dels procediments de referència primaris per a la mesura de la concentració catalítica dels enzims en un laboratori de referència

Aquest treball s'ha realitzat al Laboratori de Referència d'Enzimologia Clínica (LREC) de la Unitat de Bioquímica de Medicina. El LREC és un laboratori de referència acreditat per les normes ISO 17025 i ISO 15195, i forma part de la xarxa internacional de laboratoris de referència del Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM). Un dels requisits dels laboratoris de referència es conèixer la contribució de les diferents fonts d'incertesa a la incertesa de mesura, el que es coneix amb el nom de "compilació de la incertesa". L'objectiu d'aquest treball és l'estimació de la incertesa de mesura, mitjançant un estudi de compilació de la incertesa, de dos procediments de mesura de referència primaris: - el procediment de referència primari per la mesura de l'enzim γ-glutamil transferasa (GGT), com a exemple de procediment amb una única reacció. -el procediment de referència primari per la mesura de l'enzim creatina cinasa (CK), com a exemple de procediment amb més d'una reacció. El càlcul de la incertesa s'ha realitzat a partir dels documents "Evaluation of measurement data - Guide to the expresion of uncertainty", més conegut com GUM i desenvolupat pel Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM), i "Quantifying uncertainty in analytical measurement", recomanat per l'Eurachem. Això va implicar fer un estudi exhaustiu dels procediments de mesura de referència, que va consistir en els següents passos: a) definir el mesurant; b) identificar totes les possibles fonts d'incertesa; c) calcular la incertesa estàndard de cada font, mitjançant una avaluació de tipus A o de tipus B, d) calcular els coeficients de sensibilitat, els quals descriuen com varia el resultat del mesurant al produir canvis en cadascuna de les fonts de incertesa; e) calcular la incertesa combinada, tenint en compte la presència o no de fonts correlacionades i f) calcular la incertesa expandida amb un nivell de confiança d'aproximadament el 95 %. El valor de la incertesa de mesura estimada per el procediment de mesura de la GGT és d'un 2,2 % amb un factor de cobertura (k) de 2. De totes les fonts d'incertesa estudiades únicament 8 han contribuït a la incertesa de mesura. Aquestes fonts d'incertesa, ordenades per la importància en la contribució, són: la variabilitat expressada com la imprecisió en condicions intermèdies de mesura amb un 35,6 %, l'interferent glicina amb un 22,8 %, l'exactitud de les absorbàncies amb un 17,1 %, la longitud d'ona amb un 12,4 %, el pH amb un 8,61 %, la linealitat amb un 1,60 %, la fracció de volum de mostra amb un 1,18 %, i la temperatura amb un 0,68 %. La incertesa de mesura estimada del procediment de mesura de la CK és d'1,9 % (k=2). Les principals fonts d'incertesa amb una contribució significativa a la incertesa de mesura són: la variabilitat expressada com la imprecisió en condicions intermèdies de mesura amb un 50,1 %, l'exactitud de les absorbàncies amb un 23,2 %, el pH amb un 22,4 %, la fracció de volum de mostra amb un 2,16 %, la temperatura amb un 1,35 %, la longitud d'ona amb un 0,37 % i la linealitat amb un 0,34 %.This work has been carried out in the Laboratori de Referència d'Enzimologia Clinica (LREC) from de biochemistry and molecular biology department of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). The LREC is a reference laboratory that is accredited for the ISO 17025 and ISO 15195 standards, and also it is part of the international network of references laboratories of the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM). One of the requirements of the reference laboratories is to know the contribution of the different sources of uncertainty to the measurement uncertainty, the so called "uncertainty budget". The aim of this work is the estimation of the measurement uncertainty, through an uncertainty budget study, of two primary reference measurement procedures: - the primary reference procedure for the measurement of the catalytic concentration of γ-glutamyltransferase (GGT), as an example of procedure with one reaction. - the primary reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase (CK), as an example of procedure with different reactions. The calculation of the uncertainty has been based on the documents "Evaluation of measurement data - Guide to the expression of uncertainty," which is known as GUM and was developed by the Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM), and "Quantifying uncertainty in analytical measurement ", which is recommended by the Eurachem. So for the uncertainty estimation a comprehensive study of the reference measurement procedures was done. This study consisted of the following steps: a) definition of the measurand; b) identification of all possible sources of uncertainty; c) quantification of the standard uncertainty of each potential source of uncertainty identified, with a type A or type B evaluation; d) calculation of sensitivity coefficient, which describe how the value of the measurand varies with changes in each sources of uncertainty; e) calculation of combined uncertainty considering the presence or not of correlated sources of uncertainty, and f) calculation of expanded uncertainty with a level of confidence of approximately 95 %. The value of the measurement uncertainty estimated for the measurement procedure of GGT is 2,2 % with a coverage factor (k) of 2. From all the sources of uncertainty identified only 8 have contributed to the measurement uncertainty. This sources of uncertainty, ordered by importance in the contribution, are the following: the variability expressed as imprecision in intermediated conditions with a 35,6 %, the inhibition by glycine with a 22,8 %, the absorbance accuracy with a 17,1 %, the wavelength adjustment with a 12,4 %, the pH with a 8,61 %, the linearity with a 1,60 %, the sample volume fraction with a 1,18 % and the temperature with a 0,68 %. The measurement uncertainty estimated for the measurement procedure of CK is 1,9 % (k = 2). The main sources of uncertainty with a significant contribution to the measurement uncertainty are: the variability expressed as imprecision in intermediated conditions with a 50,1 %, the absorbance accuracy with a 23,2 %, the pH with a 22,4 %, the sample volume fraction with a 2,16 %, the temperature with a 1,35 %, the wavelength adjustment with a 0,37 % and the linearity with 0,34 %

Calcium-dependent protein kinases in the stress signaling cascades of rice plants

Les proteïnes quinasa dependents de calci (CDPKs o CPKs) són components de senyalització presents en molts aspectes de la biologia de les plantes, des dels processos de desenvolupament fins a les respostes a estrès. Aquesta tesi aborda la identificació i la caracterització funcional de les isoformes OsCPK que intervenen en la resposta de defensa de l'arròs contra els patògens, així com la seva contribució a d́altres vies de senyalització. Aquests estudis són necessaris per entendre les interaccions entre diferents vies de senyalització d'estrès i desenvolupament. Un millor coneixement d'aquestes interaccions entre vies de senyalització, i la identificació dels components que les regulen, són importants per al disseny d'estratègies de millora de la tolerància a estrès en plantes. Tots aquests estudis s'apliquen a l'arròs, un important cultiu tant econòmic com social a nivell mundial. El treball d'aquesta tesi es divideix en tres capítols. El primer capítol es centra en la identificació de gens OsCPK implicats en la resposta de defensa contra el fong del cremat de l'arròs, Magnaporthe oryzae, mitjançant una anàlisi d'expressió global. Aquests estudis es complementen amb anàlisis específiques dels perfils d'expressió en els quals s'identifiquen OsCPK4 i OsCPK10 com a gens induïts en resposta a la infecció per M. oryzae, encara que els gens OsCPK13 i OsCPK5 també responen a elicitors fúngics. El segon capítol aborda la caracterització funcional del gen OsCPK4 en la resposta de defensa de l'arròs contra M. oryzae. La sobreexpressió d́OsCPK4 confereix una millor resistència a la infecció de M. oryzae en les plantes d'arròs potenciant les seves respostes de defensa, que inclouen la producció d'espècies reactives de l'oxigen, deposicions de calosa, i l'expressió de gens de defensa. Totes s'associen a una acumulació superior d'àcid salicílic conjugat en fulles, sense comprometre el desenvolupament de les plantes. Atès que se sap que la sobreexpressió d́OsCPK4 confereix més tolerància a la salinitat i a la sequera, aquests resultats demostren que la OsCPK4 actua com a punt de convergència modulant positivament ambdues vies de senyalització d'estrès biòtic i abiòtic en plantes d'arròs. La caracterització funcional del gen OsCPK10 es presenta en el tercer capítol. Aquests estudis demostren que OsCPK10 també és un modulador positiu de la resposta de defensa contra M. oryzae i de la resposta a estrès per sequera en plantes d'arròs. L'acumulació constitutiva de la proteïna OsCPK10 confereix a les plantes d'arròs una millor tolerància a l'estrès oxidatiu causada per un increment de la capacitat antioxidant. Aquest augment de la capacitat d'eliminar el peròxid d'hidrogen tòxic produït durant la dessecació és degut en part a una acumulació més gran de Catalasa A, cosa que comporta la reducció de peroxidació lipídica i la preservació de la integritat de la membrana cel·lular, donant com a resultat la tolerància a estrès per sequera. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi identifiquen les proteïnes OsCPK4 i OsCPK10 com a components de convergència que modulen positivament ambdues vies de senyalització a estrès biòtic i abiòtic, suggerint que són bones dianes moleculars per a la millora de la tolerància a diferents estressos en les plantes d'arròsLas proteínas quinasa dependientes de calcio (CDPKs o CPKs) son componentes de señalización presentes en muchos aspectos de la biología de las plantas, desde los procesos de desarrollo hasta las respuestas a estrés. Esta tesis aborda la identificación y la caracterización funcional de las isoformas OsCPK que median la respuesta de defensa del arroz frente a patógenos, así como su contribución en otras vías de señalización. Estos estudios son necesarios para entender las interacciones entre distintas vías de señalización de estrés y desarrollo. Un mejor conocimiento de estos interacciones entre vías de señalización, y la identificación de los componentes que los regulan, son importantes para el diseño de estrategias de mejora de la tolerancia a estrés en plantas. Todos estos estudios se aplican a las plantas de arroz, un importante cultivo tanto económico como social a nivel mundial. El trabajo de esta tesis se divide en tres capítulos. El primer capítulo se centra en la identificación de genes OsCPK implicados en la respuesta de defensa frente al hongo del quemado del arroz, Magnaporthe oryzae, mediante un análisis de expresión global. Estos estudios se complementan con análisis específicos de los perfiles de expresión en los que se identifican a OsCPK4 y OsCPK10 como genes inducidos en respuesta a la infección por M. oryzae, aunque los genes OsCPK13 y OsCPK5 también responden a elicitores fúngicos. El segundo capítulo aborda la caracterización funcional del gen OsCPK4 en la respuesta de defensa del arroz frente a M. oryzae. La sobreexpresión de OsCPK4 confiere una mayor resistencia a la infección por M. oryzae en las plantas de arroz, potenciando sus respuestas de defensa, que incluyen la producción de especies reactivas del oxígeno, deposiciones de callosa, y la expresión de genes de defensa, todo ello asociado a una mayor acumulación de ácido salicílico conjugado en hojas, sin comprometer el desarrollo de las plantas. Dado que se sabe que la sobrexpresión de OsCPK4 confiere además tolerancia a salinidad y la sequía, estos resultados demuestran que la OsCPK4 actúa como punto de convergencia modulando positivamente ambas vías de señalización de estrés biótico y abiótico en plantas de arroz. La caracterización funcional del gen OsCPK10 se presenta en el tercer capítulo. Estos estudios demuestran que OsCPK10 también es un modulador positivo de la respuesta de defensa frente a la infección por M. oryzae y de la respuesta a estrés por sequía en plantas de arroz. La acumulación constitutiva de la proteína OsCPK10 confiere a las plantas de arroz una mejor tolerancia al estrés oxidativo debido a una mayor capacidad antioxidante. Esta mayor capacidad de eliminar el peróxido de hidrógeno tóxico producido durante la desecación es debida en parte a una mayor acumulación de Catalasa A, lo que conlleva la reducción de peroxidación lipídica y la preservación de la integridad de la membrana celular, dando como resultado la tolerancia a estrés por sequía. En conjunto, los resultados de esta tesis identifican las proteínas OsCPK4 y OsCPK10 como componentes de convergencia que modulan positivamente ambas vías de señalización a estrés biótico y abiótico, sugiriendo que son buenas dianas moleculares para la mejora de la tolerancia a distintos estreses en las plantas de arrozCalcium-dependent protein kinases (CDPKs or CPKs) are signaling components in many aspects of plant biology, from developmental processes to stress responses. This thesis addresses the identification and functional characterization of the OsCPK isoforms mediating the rice defense response to pathogens, as well as their contribution to other signaling pathways. These studies are important to understand the interactions between different stress signaling pathways and the development process in rice plants. A better understanding of these crosstalks among signaling pathways, as well as the identification of the signaling components mediating them, are relevant to develop strategies to improve plant stress tolerance. All these studies apply to rice plants, an economical and social important crop worldwide. The work of this thesis is divided in three chapters. The first chapter focuses on the identification of OsCPK genes involved in the defense response to the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae by global expression analysis. These studies complemented with specific expression profile analyses which identified OsCPK4 and OsCPK10 as upregulated genes in response to M. oryzae fungal infection, although the OsCPK5 and OsCPK13 genes were also responding to fungal elicitors. The second chapter addresses the functional characterization of the OsCPK4 gene in the rice defense response to the M. oryzae pathogen. The overexpression of the OsCPK4 gene conferred enhanced resistance to M. oryzae infection in rice plants by potentiating their defense responses, including the production of reactive oxygen species, callose deposition, and defense gene expression, associated to an increased accumulation of conjugated salicylic acid in leaves without compromising rice yield. Given that OsCPK4 overexpression was known to confer also salt and drought tolerance in rice, these results demonstrate that OsCPK4 acts as a convergence component that positively modulates both biotic and abiotic signaling pathways in rice. The functional characterization of the OsCPK10 gene is presented in the third chapter. These studies demonstrate that OsCPK10 is also a positive modulator of both the defense response to M. oryzae infection and the drought stress response in rice plants. The constitutive accumulation of OsCPK10 conferred the rice plants with an improved tolerance to oxidative stress by increasing their antioxidant capacity. This improved capacity to scavenge the produced toxic hydrogen peroxide upon desiccation is due in part to an increased accumulation of the Catalase A, which leads to a reduction in lipid peroxidation and preservation of the cellular membrane integrity, and as a result drought stress tolerance. All together, the results of this thesis identify the OsCPK4 and the OsCPK10 proteins as convergence components that positively modulate both biotic and abiotic signaling pathways, suggesting they are good molecular targets to improve tolerance to different stresses in rice plants