In Vitro Reconstitution of SARS-Coronavirus mRNA Cap Methylation

SARS-coronavirus (SARS-CoV) genome expression depends on the synthesis of a set of mRNAs, which presumably are capped at their 5′ end and direct the synthesis of all viral proteins in the infected cell. Sixteen viral non-structural proteins (nsp1 to nsp16) constitute an unusually large replicase complex, which includes two methyltransferases putatively involved in viral mRNA cap formation. The S-adenosyl-L-methionine (AdoMet)-dependent (guanine-N7)-methyltransferase (N7-MTase) activity was recently attributed to nsp14, whereas nsp16 has been predicted to be the AdoMet-dependent (nucleoside-2′O)-methyltransferase. Here, we have reconstituted complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We show that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-MTase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Furthermore, sensitive in vitro inhibition assays of both activities show that aurintricarboxylic acid, active in SARS-CoV infected cells, targets both MTases with IC50 values in the micromolar range, providing a validated basis for anti-coronavirus drug design

Etude d'enzymes de modification d'ARN impliquées dans la réplication des flavivirus et des coronavirus

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale.This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism

Transfert dans les sols routiers de métaux lourds issus de l'utilisation de déchets

Des enjeux de gestion des déchets poussent à la réutilisation de matériaux alternatifs en construction routière. Dans le cas des MIOM, les principaux polluants sont des métaux lourds qui peuvent être lixiviés et transférés au milieu naturel via le sol routier par les eaux d'infiltration. Le sol routier est défini comme le sol naturel sous-jacent à la chaussée, préalablement décapé et compacté. Il s'agissait de mettre en évidence la rétention de Cr, Cu, Pb et Zn, le mode de fixation de ces polluants dans le sol et les interactions entre le lixiviat et les sols routiers. L'étude sur les interactions entre des sols routiers et un lixiviat de MIOM est réalisée à partir d'essais expérimentaux en laboratoire (isothermes de sorption et simulations en colonnes) et sur le terrain en conditions climatiques réelles (plot d'essai) ainsi que de l'inspection d'un ouvrage ancien. Ces travaux ont permis de mettre en évidence la capacité des sols routiers à fixer les polluants métalliques et de relier cette capacité aux caractéristiques physico-chimiques des sols' (fraction argileuse et CEC). Les'caractéristiques des sols sont sensiblement modifiées par l'interaction avec le lixiviat avec une augmentation du pH et des teneurs en Ca. L'étude des phases porteuses par un protocole d'extraction séquentielles (BCR) et des observations au MEB, indique un lien entre la fixation des métaux et la précipitation d'une phase carbonatée ainsi que de possible redistribution des métaux sur les différentes phases du sol à plus long-terme par la comparaison avec les résultats obtenus sur l'ouvrage ancien. Ces travaux sont une approche du transfert de polluants dans un scénario d'utilisation de matériaux alternatif en construction routière avec la prise en compte du rôle du sol routier dans la rétention et le devenir des polluants métalliques.Economic stakes on raw materials and harmful effects linked to waste landfill, lead to the re-use ofNANCY/VANDOEUVRE-INPL (545472102) / SudocVILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Modulation of the organic heterojunction behavior, from electrografting to enhanced sensing properties

International audienceThe energy barrier of an organic heterojunction built on ITO electrodes and made from a low conductive sublayer (Cu(F16Pc)) covered by a highly conductive semiconductor (LuPc2) is modulated by electrografting of organic layers before depositing the sublayer. Impedance spectroscopy clearly demonstrates the increase of the energy barrier at the ITO – sublayer interface. Additionally, the electrografting is a versatile and promising method for the tuning of heterojunctions. The I(V) characteristics of the heterojunctions are highly modified by the electrografting. The same electromodifications of electrodes carried out on LuPc2 resistors lead to a modification of their transport properties too. The effect of the grafting of four different aromatic moieties bearing electron-donating and electron-withdrawing substituents is studied. One important feature is that the sensing properties are highly improved compared to the unmodified devices. Thus, the electrografting of dimethoxybenzene doubles the relative response of the heterojunction towards 90 ppm NH3, as well as the sensitivity in the range 1–9 ppm. This electrografting allows attaining a limit of detection as good as 140 ppb. The modified heterojunctions favorably compete other conductometric transducers for the detection of ammonia, at room temperature and in a broad range of relative humidity

A Comprehensive Study of Poly(2,3,5,6-tetrafluoroaniline): From Electrosynthesis to Heterojunctions and Ammonia Sensing

International audienc

Stratégies de formation de la structure coiffe chez les virus à ARN

La plupart des virus utilisent la machinerie de traduction dépendante de la coiffe pour assurer l’expression de leurs ARN messagers (ARNm). L’addition d’une structure coiffe à l’extrémité 5’ des ARNm viraux est par conséquent une étape essentielle pour la réplication de nombreux virus. En effet, la coiffe protège les ARNm de la dégradation par les nucléases cellulaires et neutralise la détection des ARNm viraux par les mécanismes de l’immunité innée. L’acquisition de la coiffe des ARN viraux se fait soit en utilisant les enzymes cellulaires de formation de la coiffe de la cellule infectée ou en subtilisant la coiffe des ARNm de la cellule infectée, soit par des machineries enzymatiques virales dédiées. De nombreuses enzymes virales impliquées dans la synthèse de la coiffe ont récemment été caractérisées du point de vue structural et fonctionnel. Ces études ont révélé des mécanismes de synthèse originaux qui ouvrent la voie pour le développement d’inhibiteurs spécifiques à potentiel antiviral

Exploration de la variabilité de la distribution de biomasse dans les arbres forestiers

International audienceNowadays, fossil fuels represent more than half the total energy consumption in developed countries. As biomass is a renewable resource and fi xes carbon when growing, there is a strong interest to use it as energy, as bio-fuel, and in construction. In some countries like France, ambitious plans for increasing harvest have been made until 2020 (namely +35% of annual wood harvesting). When dealing with such stakes, an accurate and reliable estimation of forest resource is needed. When they are built from empirical approaches, traditional biomass equations are hampered by diffi culties to extrapolate to other species and site conditions. To build biomass models that are as robust as possible, it is important to explore the variability for many species on a whole country. We gathered biomass measurements from the main seven French forest organizations into a unique database. This dataset includes volume and/or biomass for around 150,000 trees from 1920 to 2009, half of them having been precisely measured up to 0- or 4-cm diameter in stems and branches, and more than 1 million trees from the National Forest Inventory. Here we show interesting results and analyses, linked to theoretical considerations of biomass distribution in trees