Technological developments in Virtual Screening for the discovery of small molecules with novel mechanisms of action

[eng] Advances in structural and molecular biology have favoured the rational development of novel drugs thru structure-based drug design (SBDD). Particularly, computational tools have proven to be rapid and efficient tools for hit discovery and optimization. The main motivation of this thesis is to improve and develop new methods in the area of computer-based drug discovery in order to study challenging targets. Specifically, this thesis is focused on docking and Virtual Screening (VS) methodologies to be able to exploit non-standard sites, like protein-protein interfaces or allosteric sites, and discover bioactive molecules with novel mechanisms of action. First, I developed an automatic pipeline for binding mode prediction that applies knowledge- based restraints and validated the approach by participating in the CELPP Challenge, a blind pose prediction challenge. The aim of the first VS in this thesis is to find small molecules able to not only disrupt the RANK-RANKL interaction but also inhibit the constitutive activation of the receptor. With a combination of computational, biophysical, and cell-based assays we were able to identify the first small molecule binders for RANK that could be used as a treatment for Triple Negative Breast Cancer. When working with challenging targets, or with non-standard mechanisms of action, the relationship between binding and the biological response is unpredictable, because the biological response (if any) will depend on the biological function of the particular allosteric site, which is generally unknown. For this reason, we then tested the applicability of the combination of ultrahigh-throughput VS with low-throughput high content assay. This allowed us to characterize a novel allosteric pocket in PTEN and also describe the first allosteric modulators for this protein. Finally, as the accessible Chemical Space grows at a rapid pace, we developed an algorithm to efficiently explore ultra-large Chemical Collections using a Bottom-up approach. We prospectively validated the approach in BRD4 and identified novel BRD4 inhibitors with an affinity comparable to advanced drug candidates for this target.[cat] Els avenços en biologia estructural i molecular han afavorit el desenvolupament racional de nous fàrmacs a través del disseny de fàrmacs basat en l'estructura (SBDD). En particular, les eines computacionals han demostrat ser ràpides i eficients per al descobriment i l'optimització de fàrmacs. La principal motivació d'aquesta tesi és millorar i desenvolupar nous mètodes en l'àrea del descobriment de fàrmacs per ordinador per tal d'estudiar proteïnes complexes. Concretament, aquesta tesi se centra en les metodologies d'acoblament i de cribratge virtual (CV) per poder explotar llocs no estàndard, com interfícies proteïna-proteïna o llocs al·lostèrics, i descobrir molècules bioactives amb nous mecanismes d'acció. En primer lloc, vaig desenvolupar un protocol automàtic per a la predicció del mode d’unió aplicant restriccions basades en el coneixement i vaig validar l'enfocament participant en el repte CELPP, un repte de predicció del mode d’unió a cegues. L'objectiu del primer CV d'aquesta tesi és trobar petites molècules capaces no només d'interrompre la interacció RANK-RANKL sinó també d'inhibir l'activació constitutiva del receptor. Amb una combinació d'assajos computacionals, biofísics i basats en cèl·lules, vam poder identificar les primeres molècules petites per a RANK que es podrien utilitzar com a tractament per al càncer de mama triple negatiu. Quan es treballa amb proteïnes complexes, o amb mecanismes d'acció no estàndard, la relació entre la unió i la resposta biològica és impredictible, perquè la resposta biològica (si n'hi ha) dependrà de la funció biològica del lloc al·lostèric particular, que generalment és desconeguda. Per aquest motiu, després vam provar l'aplicabilitat de la combinació de CV d'alt rendiment amb assaig de contingut alt de baix rendiment. Això ens va permetre caracteritzar un nou lloc d’unió al·lostèric en PTEN i també descriure els primers moduladors al·lostèrics d'aquesta proteïna. Finalment, a mesura que l'espai químic accessible creix a un ritme ràpid, hem desenvolupat un algorisme per explorar de manera eficient col·leccions de productes químics molt grans mitjançant un enfocament de baix a dalt. Vam validar aquest enfocament amb BRD4 i vam identificar nous inhibidors de BRD4 amb una afinitat comparable als candidats a fàrmacs més avançats per a aquesta proteïna

Technological developments in Virtual Screening for the discovery of small molecules with novel mechanisms of action

Programa de Doctorat en Recerca, Desenvolupament i Control de Medicaments[eng] Advances in structural and molecular biology have favoured the rational development of novel drugs thru structure-based drug design (SBDD). Particularly, computational tools have proven to be rapid and efficient tools for hit discovery and optimization. The main motivation of this thesis is to improve and develop new methods in the area of computer-based drug discovery in order to study challenging targets. Specifically, this thesis is focused on docking and Virtual Screening (VS) methodologies to be able to exploit non-standard sites, like protein-protein interfaces or allosteric sites, and discover bioactive molecules with novel mechanisms of action. First, I developed an automatic pipeline for binding mode prediction that applies knowledge- based restraints and validated the approach by participating in the CELPP Challenge, a blind pose prediction challenge. The aim of the first VS in this thesis is to find small molecules able to not only disrupt the RANK-RANKL interaction but also inhibit the constitutive activation of the receptor. With a combination of computational, biophysical, and cell-based assays we were able to identify the first small molecule binders for RANK that could be used as a treatment for Triple Negative Breast Cancer. When working with challenging targets, or with non-standard mechanisms of action, the relationship between binding and the biological response is unpredictable, because the biological response (if any) will depend on the biological function of the particular allosteric site, which is generally unknown. For this reason, we then tested the applicability of the combination of ultrahigh-throughput VS with low-throughput high content assay. This allowed us to characterize a novel allosteric pocket in PTEN and also describe the first allosteric modulators for this protein. Finally, as the accessible Chemical Space grows at a rapid pace, we developed an algorithm to efficiently explore ultra-large Chemical Collections using a Bottom-up approach. We prospectively validated the approach in BRD4 and identified novel BRD4 inhibitors with an affinity comparable to advanced drug candidates for this target.[spa] Els avenços en biologia estructural i molecular han afavorit el desenvolupament racional de nous fàrmacs a través del disseny de fàrmacs basat en l'estructura (SBDD). En particular, les eines computacionals han demostrat ser ràpides i eficients per al descobriment i l'optimització de fàrmacs. La principal motivació d'aquesta tesi és millorar i desenvolupar nous mètodes en l'àrea del descobriment de fàrmacs per ordinador per tal d'estudiar proteïnes complexes. Concretament, aquesta tesi se centra en les metodologies d'acoblament i de cribratge virtual (CV) per poder explotar llocs no estàndard, com interfícies proteïna-proteïna o llocs al·lostèrics, i descobrir molècules bioactives amb nous mecanismes d'acció. En primer lloc, vaig desenvolupar un protocol automàtic per a la predicció del mode d’unió aplicant restriccions basades en el coneixement i vaig validar l'enfocament participant en el repte CELPP, un repte de predicció del mode d’unió a cegues. L'objectiu del primer CV d'aquesta tesi és trobar petites molècules capaces no només d'interrompre la interacció RANK-RANKL sinó també d'inhibir l'activació constitutiva del receptor. Amb una combinació d'assajos computacionals, biofísics i basats en cèl·lules, vam poder identificar les primeres molècules petites per a RANK que es podrien utilitzar com a tractament per al càncer de mama triple negatiu. Quan es treballa amb proteïnes complexes, o amb mecanismes d'acció no estàndard, la relació entre la unió i la resposta biològica és impredictible, perquè la resposta biològica (si n'hi ha) dependrà de la funció biològica del lloc al·lostèric particular, que generalment és desconeguda. Per aquest motiu, després vam provar l'aplicabilitat de la combinació de CV d'alt rendiment amb assaig de contingut alt de baix rendiment. Això ens va permetre caracteritzar un nou lloc d’unió al·lostèric en PTEN i també descriure els primers moduladors al·lostèrics d'aquesta proteïna. Finalment, a mesura que l'espai químic accessible creix a un ritme ràpid, hem desenvolupat un algorisme per explorar de manera eficient col·leccions de productes químics molt grans mitjançant un enfocament de baix a dalt. Vam validar aquest enfocament amb BRD4 i vam identificar nous inhibidors de BRD4 amb una afinitat comparable als candidats a fàrmacs més avançats per a aquesta proteïna

Lenalidomide Stabilizes Protein-Protein Complexes by Turning Labile Intermolecular H-Bonds into Robust Interactions

Targeted protein degradation is a promising therapeutic strategy, spearheaded by the anti-myeloma drugs lenalidomide and pomalidomide. These drugs stabilize very efficiently the complex between the E3 ligase Cereblon (CRBN) and several non-native client proteins (neosubstrates), including the transcription factors Ikaros and Aiolos and the enzyme Caseine Kinase 1 (CK1,), resulting in their degradation. Although the structures for these complexes have been determined, there are no evident interactions that can account for the high efficiency of formation of the ternary complex. We show that lenalidomide's stabilization of the CRBN-CK1 complex is largely due to hydrophobic shielding of intermolecular hydrogen bonds. We also find a quantitative relationship between hydrogen bond robustness and binding affinities of the ternary complexes. These results pave the way to further understand cooperativity effects in drug-induced protein-protein complexes and could help in the design of improved molecular glues and more efficient protein degraders

Development of an Automatic Pipeline for Participation in the CELPP Challenge

The prediction of how a ligand binds to its target is an essential step for Structure-Based Drug Design (SBDD) methods. Molecular docking is a standard tool to predict the binding mode of a ligand to its macromolecular receptor and to quantify their mutual complementarity, with multiple applications in drug design. However, docking programs do not always find correct solutions, either because they are not sampled or due to inaccuracies in the scoring functions. Quantifying the docking performance in real scenarios is essential to understanding their limitations, managing expectations and guiding future developments. Here, we present a fully automated pipeline for pose prediction validated by participating in the Continuous Evaluation of Ligand Pose Prediction (CELPP) Challenge. Acknowledging the intrinsic limitations of the docking method, we devised a strategy to automatically mine and exploit pre-existing data, defining-whenever possible-empirical restraints to guide the docking process. We prove that the pipeline is able to generate predictions for most of the proposed targets as well as obtain poses with low RMSD values when compared to the crystal structure. All things considered, our pipeline highlights some major challenges in the automatic prediction of protein-ligand complexes, which will be addressed in future versions of the pipeline. Keywords: D3R; automated pipeline; binding mode prediction; docking; pocket detection

Lenalidomide stabilizes protein-protein complexes by turning labile intermolecular H-bonds into robust interactions

Targeted protein degradation (TPD) is emerging as a very promising strategy to modulate protein activities in several diseases, spearheaded by anti–myeloma drugs lenalidomide and pomalidomide. It has been recently demonstrated that the mechanism of action of these drugs involves the increased degradation of several proteins, including the transcription factors Ikaros and Aiolos as well as the enzyme Caseine Kinase 1 alpha (CK1a). It has been shown that lenalidomide and pomalidomide are able to stabilize the complex between the E3 ligase Cereblon (CRL4CRBN) and the aforementioned proteins, while, remarkably, the stability of the protein-protein interaction is very low. Even though the structures for these complexes have been determined, there are no evident interactions that can account for the high formation efficiency of the ternary complex. In this work, we have leveraged Molecular Dynamics to shed light into the molecular determinants underlying the stabilization effect exerted by lenalidomide in the complex between CRL4CRBN and CK1a. Furthermore, we evaluated the effect that different mutations of CK1a in the stability of the ternary complex CRL4CRBN–lenalidomide–CK1a and provide a thermodynamic and kinetic rational for the stabilization effect. These results pave the way to further understand cooperativity effects in drug–induced protein–protein complexes and could help in the future design of improved targeted molecular degraders