Vitrification of In Vitro Produced Porcine Blastocysts: Influence of Cryoprotectants Toxicity and Embryo Age

Background: Porcine embryos are sensible to all assisted reproduction manipulations, especially the ones that involve cryopreservation. Despite the high cryoprotectant concentrations routinely applied, vitrification is the most effective technique to date. These substances toxicity can also play a negative role in embryo viability. During in vitro porcine embryo production, the speed of development is often unevenly distributed. It is possible that their development speed, affects embryo tolerance to cryoprotectants. This study aimed to evaluate the toxicity of porcine embryos of days 5 or 6 of culture to cryoprotectant agents; as well as to assess embryo survival to vitrification.Material, Methods & Results: Parthenogenetic porcine blastocysts and expanded blastocysts of days 5 and 6 of culture were exposed to toxicity tests (experiments 1 and 2) and vitrification (experiment 3) using different protocols. In the first experiment, three different cryoprotectants were used (Dimethyl sulfoxide - DMSO, Ethylene glycol – EG, and Sucrose - SUC), combined in three different associations (G1: 15% EG + 15% DMSO with 0.5M SUC; G2: 16% EG + 16% DMSO with 0.4M SUC; G3: 18% EG + 18% DMSO with 0.5M SUC). In the fresh Control, embryos of day 6 are more sensible than the ones of day 5, whom showed a lower hatching rate (39.7 vs. 60.8%). After the toxicity (Experiment 1) test, the G1 showed better expansion rates in day 6 (50.0 vs 31.0 and 3.6% for G2 and G3) and higher hatching of day 6 compared to G2 and G3 (23.2, vs. 8.6 and 0.0% for G2 and G3). The fresh non hatched embryos at day 8, derived at day 6, had a lower percentage of cells with cleaved caspase-3 (20.2%) compared with the G1 (30.5%), G2 (31.4%) and G3 (30.5%). The hatched embryos of day 5 from G2 had lower total cell number (TCN) compared with the day 6 hatched embryos, whereas in G1 the TCN was not affected. The second experiment compared EG combined to one of these three extracellular cryoprotectants: Polyvinylpyrrolidone/sucrose/trehalose (respectively groups: PVP, SUC, TRE). The group SUC has raised the best results for day 5 embryos, whereas for day 6 embryos SUC and TRE were both best. The third experiment tested four vitrification protocols, being P1: EG+DMSO+TRE/warming with SUC; P2: EG+DMSO+TRE/warming TRE; P3: EG+TRE/ warming SUC; P4: EG+TRE/warming TRE. The expansion of vitrified day 5 embryos was higher in the P1 (20.0%) in comparison with the other three groups (4.3, 4.3 and 4.4% for P2, P3 and P4, respectively), with no difference for their hatching rates, been it lower comparing to the Control. Day 6 embryos showed no difference in expansion and hatching for the vitrified groups, been them lower than the Control.Discussion: Embryos obtained on day 6 are more sensible than the ones of day 5, fact observed when the embryos were exposed to cryoprotectant solution, as well by the behavior of the no treated Control embryos. The toxicity increases as it does the concentration of intracellular cryoprotectant, where over 16% of the intracellular cryoprotectors already affected the day 6 embryos development. For the day 5 embryos however, 15 or 16% of the intracellular cryoptrotectors, had similar behavior to the embryos. For the extracellular solutions, however, it is variable according the embryos development speed. Indeed, it is necessary to adjust the cryoprotectors to be used to cryopreserve porcine in vitro produced embryos obtained at days 5 and 6 of culture

Intracytoplasmic Sperm Injection after Vitrification of Immature Oocytes in Follicular Fluid Increases Bovine Embryo Production

Background: Despite the low efficiency caused by its harmful effects, vitrification is the technique of choice for oocyte cryopeservation, especially at the germinal vesicle (GV) stage. This enables the banking of female gametes without linkage to the male genotype. Follicular fluid (FF), in vivo, is known to provide an adequate environment to the immature oocyte. The intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI), by the other hand, can be used to bypass any sperm penetration disorder, including the ones caused by cryopreservation. This study aimed to evaluate oocyte vitrification in FF based solution, and to asses ICSI efficiency in the fertilization of vitrified/warmed bovine GV oocytes.Material, Methods & Results: Follicles of 2-8 mm in diameter were aspirated from bovine ovaries obtained from a slaughterhouse, selected and maintained into FF from aspiration, until their allocation in the experimental groups. The FF used to prepare the vitrification solution was centrifuged, heat inactivated, filtered through a 0.22 mm pore and stored at -20°C. Oocyte vitrification was done into one of these three solutions: The standard solution TCM-Hepes (TH-Vitri) was compared to a totally FF based solution (FF-Vitri), and to a 50:50 (v/v) mix of both solutions (TH:FF-Vitri). Oocytes were submitted to in vitro embryo production in order to assess embryo production efficiency. A second set of experiments using the FF-Vitri solution compared IVF versus ICSI. With basis on cleaved structures, the morula + blastocyst rate obtained in the Fresh Control (43.9%) was similar to FF-Vitri (31.1%). Conversely, the TH-Vitri (15.7%) and the TH:FF-Vitri (20.4%) rates were significantly lower than the Fresh Control. ICSI showed a positive effect in comparison with IVF. The embryo development rate of Vitri-IVF (18.8%) was the lowest, whereas Vitri-ICSI (37.3%) was similar to the Fresh-IVF (43.9%), but lower than the Fresh-ICSI (57.8%).Discussion: Oocytes cryopreserved in TH based solution are known to show certain rigidity in the zona pellucida, being this event a possible cause to spermatozoa penetration disruption. Our results agree with that, since the fertilization rate for TH-Vitri was significantly lower than for the FF-Vitri. In contrast, GV oocytes vitrified in total versus partial FF based solution showed similar maturation and fertilization rates as the Fresh Control, evidencing the beneficial effect of FF during the course of vitrification. It is possible that FF helped to adjust oocyte maturation, allowing a better nuclear-cytoplasmic synchrony. Also, it might have provided some protection due to its antioxidant properties. The releasing of cortical granules induced by freezing, lead to a zona pellucida hardening and failure in sperm penetration. Factors present in the FF might block this premature releasing of cortical granules, thus ensuring that the egg retains its ability to be fertilized after maturation. The blastocysts produced from the FF-Vitri oocytes were the only ones that had the average ICM similar to the Fresh Control, evidencing that besides the similarity in morula + blastocyst rates, the embryos derived from oocytes vitrified in FF solution have also yielded best quality. When vitrified warmed oocytes were submitted to ICSI, there was an increase in the blastocyst production. This increment of embryo production with ICSI evidences a pathway to overcome the zona pellucida biological barrier. In conclusion, the use of FF as base for vitrification solution improves further embryo development; ICSI increases the embryo production of vitrified/warmed bovine GV stage oocytes

Células fetais bovinas de cultivo primário submetidas a diferentes pressões negativas antes do congelamento em palhetas

O congelamento de células é uma importante ferramenta na preservação de espécies ameaçadas de extinção. Células fetais de cultivo primário obtidas de um bovino clone foram submetidas à pressão negativa (PN) de 200, 500 ou 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou três horas antes (PN3h) do congelamento em palhetas finas, com 10% de DMSO como crioprotetor. Células frescas e congeladas sem submissão à PN foram utilizadas como controles. Avaliou-se a viabilidade pós-descongelamento, a curva de proliferação celular, assim como o tempo de duplicação da população (PDT) celular, a cada 24 horas, durante oito dias. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de Tukey ou Qui quadrado (P≤0,05). A sobrevivência média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foi superior aos outros grupos; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h). O menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). O congelamento de células fetais bovinas de cultivo primário, realizado em palhetas de 0,25 mL, com 10% de DMSO, possibilita elevadas taxas de sobrevivência após o descongelamento. A PN modifica a curva de crescimento de células criopreservadas, sendo que as intensidades de 200 ou 500 mbar, aplicadas imediatamente antes do congelamento das células, possibilitam curvas de proliferação semelhantes às obtidas com células frescas.Palavras-chave: células somáticas; criopreservação; estresse controlado; preservação animal

CONGELAMENTO ULTRA – RÁPIDO DE EMBRIÕES BOVINOS

The aim of this study was to evaluate the ultra- rapid freezing of bovine embryos in vivo produced. Eight Bos taurus cows were submitted to embryo collection on day seven after multiple ovulation estrous induction. Only embryos at the late morulae and early blastocyst stage, and classified as grade one or two, according International Embryo Transfer Society (IETS), were used. After selected, twenty-seven embryos were exposed to a solution with 3.0M of glycerol and 0.25M of sucrose in Dulbecco’s medium (DPBSm), and individually loaded in 0.25ml straw. After 10 minutes, the straw was placed on a 1.5cm height styrofoam platform maintained floating in the liquid nitrogen. The straw was maintained in the cold vapor during one minute and then plunged in the liquid nitrogen. The warming was performed by five seconds air exposure, followed by the submersion in a 35C water-bath during 20 seconds. The intracellular cryoprotectant removal was performed by the use of an osmotic 0.25M sucrose gradient, during 10 minutes, followed by DPBSm to complete the rehidration. The embryos were then loaded in 0.25ml straws and inovulated in synchronous recipients, by transcervical method. Twenty-six of twenty-seven frozen embryos were transferred, resulting in five pregnant (19.2%) recipients, and born of five healthy and normal calves. We conclude that the ultra-rapid freezing method permits the cryopreservation of in vivo bovine embryos, however the pregnancy rates are still lower than that obtained with the conventional freezing method, indicating the need of new investigations to adequate the method for bovine embryos.Com o objetivo de avaliar o método ultra–rápido no congelamento de embriões bovinos produzidos in vivo, oito vacas Bos taurus foram submetidas a coleta de embriões, sete dias após o estro subseqüente ao tratamento superovulatório. Foram utilizados embriões no estágio de mórula compacta e blastocisto jovem, com qualidade um ou dois, de acordo com os critérios da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS). Após selecionados, vinte e sete embriões foram expostos a uma solução com 3,0M de glicerol e 0,25M de sacarose em meio de Dulbeccos (DPBSm) e envasados individualmente em palhetas de 0,25ml. Após 10 minutos, as palhetas foram acondicionadas sobre uma plataforma de isopor com 1,5cm de altura, mantida flutuando sobre o nitrogênio, com exposição ao vapor gelado por um minuto, antes de serem mergulhadas no líquido. Para o descongelamento, as palhetas foram expostas ao ar por cinco segundos, seguido da imersão em banho-maria a 35oC, por 20 segundos. A remoção do glicerol intracelular foi efetuada com um gradiente osmótico de 0,25M de sacarose em DPBSm durante 10 minutos, passando a seguir para o DPBSm onde completaram a rehidratação. Dos vinte e sete embriões congelados, vinte e seis foram transferidos, resultando em cinco receptoras prenhes (19,2%) e no nascimento de cinco animais normais e saudáveis. Conclui-se que o método de congelamento ultra-rápido permite a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vivo, entretanto com índices de prenhez inferiores aos obtidos com o método de congelamento convencional, indicando a necessidade de novas investigações para adequação do método para a espécie bovina

VITRIFICAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS COM A UTILIZAÇÃO DE MICROPIPETAS DE VIDRO OU PALHETAS ESTIRADAS

To evaluate the effect of different embryo containers in vitrification procedure, oocytes obtained from 2 to 8mm size follicles were randomly allocated in three groups and submitted to maturation in TCM 199 Earle salts medium with 10% of estrus mare serum (SEE), at 39C, with 5% CO2 atmosphere and 95% of relative humidity. After 22 hours of culture, two groups were submitted to a partial remove of cumulus cells by successive pipeting in a maintenance medium (TCM-Hepes + 10% fetal calf serum) and then exposed to an equilibrium solution with 50l of EG and 50l of DMSO in 400l of maintenance medium, for 30 seconds. After that, they were transferred to a vitrification solution composed by 300l of 0.8M sucrose solution in TCM-Hepes with 20% of fetal calf serum, added with 100l of EG and 100l of DMSO, and loaded in groups of five, in glass micropipetes (MV-T1) or pulled straws (OPS-T2) and vitrified. The warming was performed by direct immersion of MV or OPS in a 0.3M Sucrose solution in maintenance medium, at 37 - 38ºC, during five minutes. The oocytes were then transferred to a 0.15M sucrose solution (five minutes) and then to a maintenance medium. Then, the oocytes of both groups returned to the maturation medium for an additional two hours culture period. All groups were then submitted to the same fertilization and culture procedures. Fertilization was performed with 1 x 106 spermatozoa/ml, selected by swim- up procedure, and the incubation of oocytes / spermatozoa was performed in 400l of TALP-FERT medium with 30g/ml of heparin, during 18–22 hours. The culture was performed in SOFaaci. The cleavage rate of 55.5%, 54.6% and 78.6% was observed in the treatments MV, OPS and Control, respectively. The blastocyst rate was 10.0 and 7.9% for the MV and OPS treatments, respectively. There was not significant differences between treatments (p>0.05) and both were inferior (p<0.05) to the Control, 42.8%. These results demonstrated that the glass micropipetes could be used in the bovine oocyte vitrification, providing similar results than those obtained with the OPS.  Com o objetivo de avaliar diferentes formas de envase no processo de vitrificação, complexos cumulus oophorus (CCOs) obtidos de folículos entre 2 e 8mm foram divididos aleatoriamente em três grupos e submetidos a maturação em TCM 199 sais de Earle com 10% de soro de égua em estro (SEE), em estufa a 39oC, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa. Com 22 horas de cultivo os grupos a serem vitrificados foram submetidos a pipetagens sucessivas para o desnudamento parcial, em uma placa contendo meio de manutenção (TCM-Hepes com 10% de soro fetal bovino - SFB), sendo então expostos a uma solução de equilíbrio composta por 400l de meio de manutenção, adicionado de 50l de EG e 50l de DMSO, por 30 segundos. Em seguida foram transferidos para a solução de vitrificação composta por 300l de uma solução de sacarose 0,8M em TCM-Hepes com 20% SFB, acrescido de 100l de EG e 100l de DMSO, envasados em grupos de cinco, em micropipetas de vidro (MV T1) ou palhetas estiradas (OPS T2) e vitrificados. O reaquecimento foi realizado pela imersão direta das MV e OPS numa solução de Sacarose 0,3M em meio de manutenção, a 37 – 38ºC, onde os CCOs permaneceram por cinco minutos, quando foram transferidos para uma solução com 0,15M de sacarose por mais cinco minutos, antes de retornarem para o meio de manutenção. A seguir os ovócitos dos dois grupos retornaram ao meio de maturação por mais duas horas. A partir de então, todos os grupos foram submetidos aos mesmos procedimentos de fecundação e cultivo. Para a fecundação utilizou-se sêmen selecionado pelo processo de migração ascendente (swim-up), em meio TALP-SPERM, utilizando-se uma concentração final de 1 x 106 espermatozóides/ml. A incubação dos ovócitos com espermatozóides foi realizada por 18 – 22 horas, em 400l do meio TALP-FERT, adicionado de 30g/ml de heparina. O cultivo foi realizado em SOFaaci, sendo avaliadas as taxas de clivagem e blastocistos. Observou-se uma taxa de clivagem de 55,5, 54,6 e 78,6% para os tratamentos MV, OPS e Controle, respectivamente. A taxa de blastocistos foi 10,0 e 7,9% para os tratamentos MV e OPS, respectivamente, que não diferiram entre si (p>0,05) e foram inferiores (p<0,05) aos 42,8% do tratamento controle. Os resultados deste estudo demonstram que as micropipetas de vidro estiradas podem ser utilizadas na vitrificação de ovócitos bovinos, proporcionando resultados semelhantes aqueles obtidos com as palhetas estiradas. &nbsp

Aspiração folicular em vacas Bos taurus e Bos indicus e vitrificação dos oócitos em condições de campo

The aim of this study was to evaluate the viability of cryopreservation of bovine oocytes from Bos taurus and Bos indicus cows, at field conditions. The average rate of oocyte recovered by Ovum Pick up (OPU) from Bos taurus taurus cows (Devon) or Bos taurus indicus cows (Nelore), and the embryo development after vitrification were determined. After 60 sessions, an average rate of 4.6 oocytes/session was obtained from Devon cows. This number was significantly lower than the 16.3 oocytes obtained from Nelore cows, in 12 sessions. Selected recovered oocytes were vitrified in 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose, in TCM 199 medium, with open pulled straws (OPS) technology, and stored in a cryogenic container. Just after warmed, oocytes were submitted to standard in vitro maturation, fertilization and culture in the laboratory. There were no differences in cleavage rates obtained from Devon cows oocytes (17.6%) and Nelore cows oocytes (29.1%). Evaluation of embryo development resulted in only one blastocyst obtained from Devon cows. Data from this study showed that Bos taurus indicus cows had higher oocytes recovery rates when compared with Bos taurus taurus, and that association of OPU with oocytes vitrification at farm conditions resulted in unsatisfactory indexes of embryo development, regardless of cow breed.Com o objetivo de avaliar a viabilidade da criopreservação de oócitos de fêmeas taurinas e zebuínas em condição de campo, este estudo determinou a taxa média de oócitos obtidos por punção folicular in vivo (OPU) de fêmeas bovinas Bos taurus taurus (Devon) e Bos taurus indicus (Nelore), bem como o desenvolvimento embrionário após a vitrificação destes oócitos. Em 60 sessões, obteve-se média de 4,6 oócitos por sessão de OPU nas vacas Devon, número significativamente inferior aos 16,3 oócitos obtidos nas vacas Nelore, em 12 sessões. Os oócitos selecionados foram vitrificados em solução de 20% de EG + 20% de DMSO + 0,5 M de sacarose, em meio TCM 199, utilizando-se palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi efetuado em laboratório, seguindo-se a maturação, fecundação e cultivo in vitro. As taxas de clivagem obtidas foram 17,6% no grupo de vacas Devon e 29,1% no grupo Nelore, não havendo diferença significativa entre as mesmas. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, obteve-se apenas um blastocisto no grupo Devon. Concluiu-se que fêmeas zebuínas (Nelore) proporcionam maior taxa de oócitos recuperados por sessão em relação às fêmeas taurinas (Devon), e que a associação da OPU com a vitrificação dos oócitos na própria fazenda não proporciona taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário, independente da origem dos animais

Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou em o uso de nitrogênio super-resfriado

O total aproveitamento de embriões PIV ainda depende de uma metodologia eficiente de criopreservação. Este estudo avaliou a taxa de eclosão de embriões bovinos PIV, vitrificados em OPS usando três diferentes soluções crioprotetoras (Experimento 1) e o emprego de nitrogênio normal (-196°C) ou super-resfriado (-210°C) (Experimento 2). No primeiro experimento (12 repetições) 576 blastocistos expandidos (Bx) PIV foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: G1 (20% EG + 20% DMSO), G2 (25% EG + 25% GLI), G3 (20% EG + 20% PRO) e G4 (controle não vitrificado). Após 72 horas de cultivo in vitro, a taxa de eclosão do grupo controle (84,0%) foi superior às observadas nos grupos vitrificados (

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos  cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio seguido por uma etapa de captação específica do mRNA. Após a utilização da técnica de RT-PCR para a obtenção do cDNA e amplificação dos quatro fragmentos específicos, a análise dos resultados não mostrou diferença significativa entre os grupos para a abundância relativa dos transcritos de link protein (p=0,486), HAS2 (p=0,394), conexina 43 (p=0,116) e HSP70-1 (p=0,248)