The GCN2 kinase is required for activating autophagy in response to indispensable amino acid deficiencies

ORGANIZING COMMITTEEChairs: Didier Attaix - Lydie Combaret - Daniel TaillandierDaniel Béchet - Agnès Claustre - Cécile Coudy-Gandilhon - Christiane Deval - Gérard Donadille - Cécile PolgeSCIENTIFIC COMMITTEEDidier Attaix - Lydie Combaret - Alfred L. Goldberg - Ron Hay - Germana Meroni - Marco Sandri - Daniel Taillandier - Keiji Tanaka - Simon S. WingPoster Session 3 - AutophagyImbalances in dietary amino acid (AA) supply, including deficits in one or more indispensable amino acids (IAA), are stressful conditions for the organism that needs to modulate a number of physiological functions to adapt to this situation. In particular, since there is no system dedicated for storing AA in the body, the release of free AA occurs by proteolysis at the expense of functional proteins, notably in the liver by up-regulating autophagy. This process can be rapidly mobilized within the cell in response to a number of stresses, by post-translational regulations of autophagy-related proteins already present in the cytosol. The protein kinase GCN2 is activated upon IAA scarcity in order to promote cell adaptation to a nutritional stress condition. In response to IAA limitation, GCN2 couples the accumulation of uncharged transfer RNAs to the phosphorylation of eIF2a on serine 51. By this mean, GCN2 diminishes the overall protein synthesis rate, while simultaneously activating a gene expression program mediated by the translational upregulation of the transcription factor ATF4. Our recent work has shown that the GCN2/p-eIF2a/ATF4 signaling pathway plays an essential role in the induction of transcription of a number of autophagy-related genes involved in the maintenance of the autophagic process in response to an IAA deficiency (B’chir et al., 2013). In the present study we sought to determine whether GCN2 could play a role in regulating the early stages of autophagy. The most upstream complex for triggering the autophagic process (initiation complex) is notably composed of the ULK kinase and the ATG13 bridging protein, and is classically viewed to be controlled by mTORC1. Indeed, the activity of the autophagy initiation complex has been shown to be modulated according to AA availability by the activity of mTORC1, which phosphorylates different sites in ULK. Here, by using a GCN2 knock-out mouse model we investigated the role of GCN2 in the upregulation of autophagy in the first hour of an IAA deficiency. Our results show that 1) GCN2 is required for upregulating liver autophagy in response to an IAA-deficient diet, which is confirmed in cell culture model; 2) this early activation of the autophagic process does not require the transcription factor ATF4; 3) moreover, while this effect can occur without concomitant inhibition of mTORC1 activity, our results suggest that ULK/ATG13 couple is involved in the GCN2-dependent activation of autophagy. Our results demonstrate that in the particular model of an IAA deficiency GCN2 plays a preponderant role in triggering the adaptive autophagy upregulation, a mechanism which can operate without concomitant inhibition of mTORC1 activit

Identification des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance des cellules à la carence en acides aminés

Tumor development can be characterized by the formation of hypoxic area deprived in nutrients. Due to their genetic instability, tumor cells can become resistant to this apoptotic condition. Among the resistance mechanisms, those involved in cell survival against amino acids restriction is poorly known. Amino acids deprivation is particularly deleterious as nine of them cannot be synthetized de novo. The aim of this work was to identify the mechanisms by which tumor cells can survive to long-term amino acids deprivation. For that purpose, we exerted a selective pressure on mouse embryonic fibroblast by exposing them to amino acids deprivation for several months. We generated clones able to survive and proliferate in deprived amino acids medium. On a first hand, we characterized the capacity of proliferation and survival of several resistant clones in amino acid deprivation condition. On a second hand, we studied several signaling pathways which are regulated during this condition. We have found that every clones present an alteration of the GCN2 pathway, and notably, a low expression of its major actor, the protein ATF4, when compared to the parental cells. We have shown with shRNA experiment that this underexpression promotes cell survival during amino acid deprivation. The association between decreased expression of ATF4 and better survival in amino acid deprivation condition was also found in a pancreatic cancer cell line, BxPC-3. ATF4 overexpression in this resistant cell line restores the apoptotic effect of ATF4 during amino acid deprivation. We have also studied how cells can provide themselves in amino acids from the extracellular environment. We have observed that one of the clone cell line presents a high level of macropinocytosis and that, the inhibition of this mechanism decreases its survival during amino acid deprivation. Thanks to our approach, we were able to highlight mechanisms which confers to cell resistance to amino acid deprivation. By observing those mechanisms in cancer cell lines, we confirmed the relevance of our approach to identify such mechanisms

Identification des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance des cellules à une carence en acides aminés.

Tumor development can be characterized by the formation of hypoxic area deprived in nutrients. Due to their genetic instability, tumor cells can become resistant to this apoptotic condition. Among the resistance mechanisms, those involved in cell survival against amino acids restriction is poorly known. Amino acids deprivation is particularly deleterious as nine of them cannot be synthetized de novo. The aim of this work was to identify the mechanisms by which tumor cells can survive to long-term amino acids deprivation. For that purpose, we exerted a selective pressure on mouse embryonic fibroblast by exposing them to amino acids deprivation for several months. We generated clones able to survive and proliferate in deprived amino acids medium. Firstly, we characterized the capacity of proliferation and survival of several resistant clones in amino acid deprivation condition. Secondly, we studied several signaling pathways which are regulated during this condition. We have found that every clones present an alteration of the GCN2 pathway, and notably, a low expression of its major actor, the protein ATF4, when compared to the parental cells. We have shown with shRNA experiment that this underexpression promotes cell survival during amino acid deprivation. The association between decreased expression of ATF4 and better survival in amino acid deprivation condition was also found in a pancreatic cancer cell line, BxPC-3. ATF4 overexpression in this resistant cell line restores the apoptotic effect of ATF4 during amino acid deprivation. We have also studied how cells can provide themselves in amino acids from the extracellular environment. We have observed that one of the clone cell line presents a high level of macropinocytosis and that, the inhibition of this mechanism decreases its survival during amino acid deprivation. Thanks to our approach, we were able to highlight mechanisms which confers to cell resistance to amino acid deprivation. By observing those mechanisms in cancer cell lines, we confirmed the relevance of our approach to identify such mechanisms.Le développement anarchique de tumeurs peut conduire à la formation de régions hypoxiques carencées en nutriments. A cause de l’instabilité génétique des cellules cancéreuses, certaines peuvent développer des résistances à ces conditions proapoptotiques. Parmi ces mécanismes de résistance, ceux impliqués dans la survie des cellules face à la carence prolongée en acides aminés n’ont pas été élucidés. La carence en acides aminés est particulièrement délétère pour les cellules de par leur importance dans le métabolisme cellulaire et l’impossibilité pour 9 d’entre eux d’être synthétisée de novo. L’objectif de ce travail était de déterminer les mécanismes permettant aux cellules cancéreuses de survivre face à la carence prolongée en acides aminés. Pour cela, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en acides aminés pendant plusieurs mois. Des clones capables de survivre et de proliférer dans ce milieu ont été générés. Le travail de thèse a d’abord consisté à caractériser la résistance de plusieurs clones à la carence en acides aminés et notamment, les voies de signalisation régulées par cette situation. Parmi ces dernières, nous avons pu observer que les clones par rapport aux cellules parentales présentaient une altération de la voie GCN2, et plus précisément, une sous-expression d’un des acteurs majeurs de cette voie, la protéine ATF4. Par des expériences de shRNA, nous avons pu mettre en évidence que cette sous-expression favorisait la survie des clones en milieu carencé en acides aminés. L’association entre survie et sous-expression d’ATF4 a également pu être faite dans une lignée de cancer du pancréas, BxPC-3. En rétablissant l’expression d’ATF4, les cellules résistantes redevenaient sensibles aux effets apoptotiques de la carence en acides aminés, confirmant le rôle apoptotique d’ATF4 lors de carence en acides aminés prolongée. Nous nous sommes également intéressés aux mécanismes que les cellules utilisaient pour se fournir en acides aminés à partir des protéines du milieu extracellulaire. Nous avons pu identifier qu’une des lignées de clones présentait un fort niveau de macropinocytose et que son inhibition lors de carence en acides aminés diminuait ses capacités de survie lors de carences en acides aminés. Notre approche a ainsi pu mettre en évidence des mécanismes de résistances des cellules à la carence en acides aminés. Ces mécanismes ont ensuite pu être observés dans des lignées cancéreuses, confirmant la pertinence de notre modèle pour l’identification de tels mécanismes

Identification of molecular mechanism involved in cell resistance to amino acid deprivation

Le développement anarchique de tumeurs peut conduire à la formation de régions hypoxiques carencées en nutriments. A cause de l’instabilité génétique des cellules cancéreuses, certaines peuvent développer des résistances à ces conditions proapoptotiques. Parmi ces mécanismes de résistance, ceux impliqués dans la survie des cellules face à la carence prolongée en acides aminés n’ont pas été élucidés. La carence en acides aminés est particulièrement délétère pour les cellules de par leur importance dans le métabolisme cellulaire et l’impossibilité pour 9 d’entre eux d’être synthétisée de novo. L’objectif de ce travail était de déterminer les mécanismes permettant aux cellules cancéreuses de survivre face à la carence prolongée en acides aminés. Pour cela, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en acides aminés pendant plusieurs mois. Des clones capables de survivre et de proliférer dans ce milieu ont été générés. Le travail de thèse a d’abord consisté à caractériser la résistance de plusieurs clones à la carence en acides aminés et notamment, les voies de signalisation régulées par cette situation. Parmi ces dernières, nous avons pu observer que les clones par rapport aux cellules parentales présentaient une altération de la voie GCN2, et plus précisément, une sous-expression d’un des acteurs majeurs de cette voie, la protéine ATF4. Par des expériences de shRNA, nous avons pu mettre en évidence que cette sous-expression favorisait la survie des clones en milieu carencé en acides aminés. L’association entre survie et sous-expression d’ATF4 a également pu être faite dans une lignée de cancer du pancréas, BxPC-3. En rétablissant l’expression d’ATF4, les cellules résistantes redevenaient sensibles aux effets apoptotiques de la carence en acides aminés, confirmant le rôle apoptotique d’ATF4 lors de carence en acides aminés prolongée. Nous nous sommes également intéressés aux mécanismes que les cellules utilisaient pour se fournir en acides aminés à partir des protéines du milieu extracellulaire. Nous avons pu identifier qu’une des lignées de clones présentait un fort niveau de macropinocytose et que son inhibition lors de carence en acides aminés diminuait ses capacités de survie lors de carences en acides aminés. Notre approche a ainsi pu mettre en évidence des mécanismes de résistances des cellules à la carence en acides aminés. Ces mécanismes ont ensuite pu être observés dans des lignées cancéreuses, confirmant la pertinence de notre modèle pour l’identification de tels mécanismes.Tumor development can be characterized by the formation of hypoxic area deprived in nutrients. Due to their genetic instability, tumor cells can become resistant to this apoptotic condition. Among the resistance mechanisms, those involved in cell survival against amino acids restriction is poorly known. Amino acids deprivation is particularly deleterious as nine of them cannot be synthetized de novo. The aim of this work was to identify the mechanisms by which tumor cells can survive to long-term amino acids deprivation. For that purpose, we exerted a selective pressure on mouse embryonic fibroblast by exposing them to amino acids deprivation for several months. We generated clones able to survive and proliferate in deprived amino acids medium. Firstly, we characterized the capacity of proliferation and survival of several resistant clones in amino acid deprivation condition. Secondly, we studied several signaling pathways which are regulated during this condition. We have found that every clones present an alteration of the GCN2 pathway, and notably, a low expression of its major actor, the protein ATF4, when compared to the parental cells. We have shown with shRNA experiment that this underexpression promotes cell survival during amino acid deprivation. The association between decreased expression of ATF4 and better survival in amino acid deprivation condition was also found in a pancreatic cancer cell line, BxPC-3. ATF4 overexpression in this resistant cell line restores the apoptotic effect of ATF4 during amino acid deprivation. We have also studied how cells can provide themselves in amino acids from the extracellular environment. We have observed that one of the clone cell line presents a high level of macropinocytosis and that, the inhibition of this mechanism decreases its survival during amino acid deprivation. Thanks to our approach, we were able to highlight mechanisms which confers to cell resistance to amino acid deprivation. By observing those mechanisms in cancer cell lines, we confirmed the relevance of our approach to identify such mechanisms

Adaptation to the availability of essential amino-acids: role of GCN2/eIF2α/ATF4 pathway

In mammals, metabolic adaptations are required to overcome nutritional deprivation in amino-acids/proteins as well as episodes of malnutrition. GCN2 protein kinase, which phosphorylates the α subunit of the translation initiation factor eIF2, is a sensor of amino-acid(s) deficiencies. On one hand, this review briefly describes the main features of amino-acid metabolism. On the other hand, it describes the role of GCN2 in regulating numerous physiological functionsChez les mammifères, des systèmes d’adaptation du métabolisme sont nécessaires afin de surmonter les privations nutritionnelles en acides aminés/protéines, ainsi que certains épisodes de malnutrition. La protéine kinase GCN2, qui phosphoryle la sous-unitéα du facteur d’initiation de la traduction eIF2, est un détecteur des déficits en acides aminés. Dans un premier temps, cette revue décrit brièvement les principales caractéristiques du métabolisme des acides aminés. Dans un deuxième temps, elle décrit le rôle de GCN2 dans la régulation de nombreuses fonctions physiologique

Identification of molecular mechanisms involved in cancer cell resistance to amino acid deprivation

International audienc

L’activation de la voie eIF2α-ATF4, une réponse adaptative au stress cellulaire

L’activation de la voie eIF2α-ATF4, une réponse adaptative au stress cellulair

Identification des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance des cellules à une carence en acides aminés

Cette année les assises sont en partenariat avec le Pôle de compétitivité Lyonbiopôle et le cluster Nutravita, des symposiums thématiques portant sur les interactions entre la recherche académique, l’innovation et l’industrie seront proposésLes cellules tumorales situées au coeur de tumeur sont soumises à une forte carence en nutriments et seules les cellules développant des mécanismes de résistance à ces carences vont pouvoir survivre. Les acides aminés (AA) sont particulièrement limitants du fait que certains AA ne peuvent pas être synthétisés de novo par la cellule. Dans un premier temps, face à un déficit en AA, la cellule va pouvoir s’adapter via la modulation de deux voies de signalisation: mTORC1 et GCN2/eIF2α/ATF4. Néanmoins cette adaptation ne peut être que transitoire, si le déficit perdure une sélection génétique des cellules acquérant des mécanismes de résistance peut s’opérer. Afin d’identifier ces mécanismes de résistance de cellules à un déficit prolongé en AA, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en AA pendant plusieurs mois ce qui a amené à la génération de clones capables de survire dans ce milieu. Contrairement aux cellules parentales, les clones ont la capacité de proliférer en milieu carencé en AA et de résister à la mort cellulaire induite par ce milieu. L’étude des voies de signalisation régulées par les AA a mis en évidence que malgré la phosphorylation d’eIF2α, le niveau d’expression d’ATF4 dans les clones est significativement plus faible que celui des cellules parentales. Cette sous-expression se traduit par un défaut d’expression des gènes cibles d’ATF4 dans les clones. L’étude de 2 lignées tumorales a mis en évidence une altération de la voie GCN2/eIF2α/ATF4 dans la lignée présentant la plus forte capacité de résistante à la carence en AA. Il n’existe pas de consensus dans la littérature quant au rôle de la voie GCN2/eIF2α/ATF4 en faveur de la survie ou la mort des cellules. Si la phosphorylation d’eIF2α ne semble pas délétère pour la survie, nos données suggèrent que l’expression d’ATF4 serait défavorable à la survie. D’autres expériences sont en cours afin de mieux caractériser le rôle de cette voie dans la survie des clone

Decreased ATF4 expression as a mechanism of acquired resistance to long-term amino acid limitation in cancer cells

The uncontrolled growth of tumor can lead to the formation of area deprived in nutrients. Due to their high genetic instability, tumor cells can adapt and develop resistance to this pro-apoptotic environment. Among the resistance mechanisms, those involved in the resistance to long-term amino acid restriction are not elucidated. A long-term amino acid restriction is particularly deleterious since nine of them cannot be synthetized by the cells. In order to determine how cancer cells face a long-term amino acid deprivation, we developed a cell model selected for its capacity to resist a long-term amino acid limitation. We exerted a selection pressure on mouse embryonic fibroblast to isolate clones able to survive with low amino acid concentration. The study of several clones revealed an alteration of the eiF2alpha/ATF4 pathway. Compared to the parental cells, the clones exhibited a decreased expression of the transcription factor ATF4 and its target genes. Likewise, the knock-down of ATF4 in parental cells renders them resistant to amino acid deprivation. Moreover, this association between a low level of ATF4 protein and the resistance to amino acid deprivation was also observed in the cancer cell line BxPC-3. This resistance was abolished when ATF4 was overexpressed. Therefore, decreasing ATF4 expression may be one important mechanism for cancer cells to survive under prolonged amino acid deprivatio

Method for collecting mouse milk without exogenous oxytocin stimulation

It has been reported that breast-feeding more than 6 months strongly decreases the risk of allergy, diabetes, obesity, and hypertension in humans. In order to understand the mechanisms responsible for this benefit, it is important to evaluate precisely the composition of maternal milk, especially in response to environmental cues. Mouse models offer a unique opportunity to study the impact of maternal milk composition on the development and health of offspring. Oxytocin injection of the dam is usually used to stimulate milk ejection; however, exogenous oxytocin might have deleterious effects under some experimental conditions by modifying milk content as well as the physiology and behavior of the dam. Taking advantage of the natural stimulation of the mammary gland that occurs after the reunion of a dam that has been separated from her pups, we developed a new procedure to collect mouse milk without the injection of oxytocin. This method is easy to use, low-cost ,and non-invasive. Moreover, it provides a sufficient amount of milk for use in a wide range of biological analyses