Influence of vitamin D deficiency in gene expression profiles during osseointegration

Orientador: Celia Marisa Rizzatti-BarbosaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: A deficiência de vitamina D pode representar um fator de risco para a perda de implantes. Os objetivos deste estudo foram: (a) investigar a influência da deficiência de vitamina D nos padrões de expressão gênica durante a osseointegração in vivo, e (b) avaliar a influência da vitamina D e do titânio na expressão de genes relacionados ao metabolismo ósseo in vitro. Para atingir o primeiro objetivo, dezesseis ratos foram distribuídos em quatro grupos segundo o tipo de dieta recebida e à inserção ou não de implante em seus fêmures: OSTV+ (dieta padrão/ osteotomia), OSTV- (dieta deficiente de vitamina D/ osteotomia), NTV+ (dieta padrão/ inserção de implante) e NTV- (dieta deficiente de vitamina D/ inserção de implante). Duas semanas após a cirurgia, o RNA foi isolado a partir do tecido ósseo, e as expressões de aproximadamente 41.000 transcritos foram determinadas pela tecnologia de microarray. A comparação entre os grupos foi realizada através de ANOVA bifatorial (correção de Benjamini-Hochberg, pY0,05). Investigou-se a provável co-regulação e função dos genes alterados através da aplicação de algoritmos de clusterização (hierárquico e PAM) e comparação com os bancos de dados da KEGG e Ontologia Gênica. Para abordar o segundo objetivo, células multipotentes de medula óssea foram cultivadas sobre superfícies plásticas ou discos de titânio, com meio de cultura suplementado ou não com vitamina D. O RNA foi extraído das células após um, três, sete e quatorze dias de cultura e as expressões dos genes de colágeno tipos I, II e X, osteocalcina, osteopontina, osteonectina, RUNX2 e SOX9 foram medidas por RT-PCR. Os resultados mostraram que a expressão de 1.668 transcritos foi alterada in vivo. Esta alteração foi atribuída à inserção do implante em 1.661 transcritos, à deficiência de vitamina D em 13 transcritos (entre eles: NPAS2, Per2, GILZ, IGFBP3, Fra1, B29 e RGD1564491); e à interação entre os dois fatores em 7 transcritos (entre eles: EPO, Cyp2b15, Pole e CTTNBP2). Os genes agruparam-se em dois padrões alterados de expressão onde a inserção de implante induziu (1.080 transcritos) ou suprimiu (588 transcritos) a expressão gênica, e a deficiência de vitamina D atenuou a expresão. Estes genes participaram de cinco processos durante a osseointegração: formação de matriz extracelular, controle do metabolismo ósseo, angiogênese, proliferação celular e resolução da inflamação e resposta imune. Os genes integrantes de matriz extracelular mais afetados pela inserção do implante in vivo foram colágeno tipos II e X. A clusterização hierárquica mostrou que o gene NPAS2 localizou-se no cluster do colágeno tipos II e X, enquanto o Per2 localizou-se no cluster do TSC22, B29 e RGD1564491. In vitro, a expressão do colágeno tipos II e X foi induzida após um dia quando as células foram cultivadas sobre discos de titânio, mas não foi afetada pela vitamina D. Concluiu-se que a deficiência de vitamina D afetou a expressão gênica após durante a osseointegração; a expressão dos colágenos II e X aumentou quando da presença de titânio (in vivo e in vitro), e reduziu quando da deficiência de vitamina D (in vivo, mas não in vitro).Abstract: Vitamin-D deficiency has been considered as systemic risk factor for impaired osseointegration. Our aims were: (a) to verify the influence of vitamin D deficiency in gene expression profiles during osseointegration in vivo, and (b) to evaluate the effect of vitamin D supplementation and titanium on the expression of genes related to bone metabolism in vitro. For the first experiment, sixteen rats were allocated into 4 groups according to the diet type and surgical procedures in their fêmurs: OSTV+ (standard diet/ osteotomy), OSTV- (vitamin D deficient diet/ osteotomy), NTV+ (standard diet/ insertion of implant), and NTV- (vitamin D deficient diet/ insersion of implant). RNA was isolated after two weeks of healing and Agilent-Microarray was used to screen 41,000 genes. Two-way ANOVA (Benjamini-Hochberg correction, pY0.05) was used to compare expression among the groups. Hierarchical and PAM clusterization, statistical analysis of KEGG pathways (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) and GO (Gene Ontology) were used to investigate the putative co-regulation and function of differently expressed genes. For the in vitro experiment, femoral bone marrow multipotent precursors were cultured on plastic dishes or titanium disks, with or without vitamin D supplementation. RNA was isolated after 1, 3, 7 and 14 days of culture and the expression of collagen types II and X was measured by RTPCR. We found a total of 1,668 differently expressed transcripts among which 1,661 transcripts were differently expressed due to insertion of implant effect; 13 were due to vitamin D deficiency effect (such as: NPAS2, Per2, GILZ, IGFBP3, Fra1, B29 and RGD1564491); and 7 due to the interaction effect between these two factors (such as: EPO, Cyp2b15, Pole and CTTNBP2). From PAM clusterization, the differently expressed genes were grouped into two expression profiles, in which implant was the main inducer of over-expression (1,080 genes) or under-expression (588 genes), while the vitamin-D deficiency attenuated the expression of these genes during osseointegration. From 16 KEGG pathways over-represented by our genelist, we could summarize five main processes occurring at two-week osseointegration: formation of extracellular matrix and cell-interaction; angiogenesis; resolution of inflammation and immune response; control of bone metabolism; and cell proliferation. Hierarchical clusterization showed that Per2 colocalized with TSC22, B29 and RGD1564491, while NPAS2 co-localized with collagen types II and X. GO analysis demonstrated that collagen types II and X were the most affected extracellular matrix genes by the vitamin D deficiency. The expression of collagen types II and X was significantly increased at an early stage (day 1) when cells were cultured on titanium disks regardless the vitamin D condition in the media. We concluded that vitamin D deficiency negatively affected gene expression after 2-week osseointegration; and the expression of collagen types II and X increased when titanium was present (in vivo and in vitro) and decreased under the vitamin D deficiency (in vivo, but not in vitro).DoutoradoProtese DentalDoutor em Clínica Odontológic