Targeted high throughput sequencing in clinical cancer Settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Massively parallel sequencing technologies have brought an enormous increase in sequencing throughput. However, these technologies need to be further improved with regard to reproducibility and applicability to clinical samples and settings.</p> <p>Methods</p> <p>Using identification of genetic variations in prostate cancer as an example we address three crucial challenges in the field of targeted re-sequencing: Small nucleotide variation (SNV) detection in samples of formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue material, minimal amount of input sample and sampling in view of tissue heterogeneity.</p> <p>Results</p> <p>We show that FFPE tissue material can supplement for fresh frozen tissues for the detection of SNVs and that solution-based enrichment experiments can be accomplished with small amounts of DNA with only minimal effects on enrichment uniformity and data variance.</p> <p>Finally, we address the question whether the heterogeneity of a tumor is reflected by different genetic alterations, e.g. different foci of a tumor display different genomic patterns. We show that the tumor heterogeneity plays an important role for the detection of copy number variations.</p> <p>Conclusions</p> <p>The application of high throughput sequencing technologies in cancer genomics opens up a new dimension for the identification of disease mechanisms. In particular the ability to use small amounts of FFPE samples available from surgical tumor resections and histopathological examinations facilitates the collection of precious tissue materials. However, care needs to be taken in regard to the locations of the biopsies, which can have an influence on the prediction of copy number variations. Bearing these technological challenges in mind will significantly improve many large-scale sequencing studies and will - in the long term - result in a more reliable prediction of individual cancer therapies.</p

Somatic Mutation Profiles of MSI and MSS Colorectal Cancer Identified by Whole Exome Next Generation Sequencing and Bioinformatics Analysis

BACKGROUND: Colorectal cancer (CRC) is with approximately 1 million cases the third most common cancer worldwide. Extensive research is ongoing to decipher the underlying genetic patterns with the hope to improve early cancer diagnosis and treatment. In this direction, the recent progress in next generation sequencing technologies has revolutionized the field of cancer genomics. However, one caveat of these studies remains the large amount of genetic variations identified and their interpretation. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Here we present the first work on whole exome NGS of primary colon cancers. We performed 454 whole exome pyrosequencing of tumor as well as adjacent not affected normal colonic tissue from microsatellite stable (MSS) and microsatellite instable (MSI) colon cancer patients and identified more than 50,000 small nucleotide variations for each tissue. According to predictions based on MSS and MSI pathomechanisms we identified eight times more somatic non-synonymous variations in MSI cancers than in MSS and we were able to reproduce the result in four additional CRCs. Our bioinformatics filtering approach narrowed down the rate of most significant mutations to 359 for MSI and 45 for MSS CRCs with predicted altered protein functions. In both CRCs, MSI and MSS, we found somatic mutations in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein receptor 1A, BMPR1A, a gene where so far germline mutations are associated with juvenile polyposis syndrome, and show that the mutations functionally impair the protein function. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We conclude that with deep sequencing of tumor exomes one may be able to predict the microsatellite status of CRC and in addition identify potentially clinically relevant mutations

FOX-2 Dependent Splicing of Ataxin-2 Transcript Is Affected by Ataxin-1 Overexpression

Alternative splicing is a fundamental posttranscriptional mechanism for controlling gene expression, and splicing defects have been linked to various human disorders. The splicing factor FOX-2 is part of a main protein interaction hub in a network related to human inherited ataxias, however, its impact remains to be elucidated. Here, we focused on the reported interaction between FOX-2 and ataxin-1, the disease-causing protein in spinocerebellar ataxia type 1. In this line, we further evaluated this interaction by yeast-2-hybrid analyses and co-immunoprecipitation experiments in mammalian cells. Interestingly, we discovered that FOX-2 localization and splicing activity is affected in the presence of nuclear ataxin-1 inclusions. Moreover, we observed that FOX-2 directly interacts with ataxin-2, a protein modulating spinocerebellar ataxia type 1 pathogenesis. Finally, we provide evidence that splicing of pre-mRNA of ataxin-2 depends on FOX-2 activity, since reduction of FOX-2 levels led to increased skipping of exon 18 in ataxin-2 transcripts. Most striking, we observed that ataxin-1 overexpression has an effect on this splicing event as well. Thus, our results demonstrate that FOX-2 is involved in splicing of ataxin-2 transcripts and that this splicing event is altered by overexpression of ataxin-1

High Throughput Sequence Analyses of Somatic- and Germline Mutations in Patients with Non-small-cell Lung Cancer (NSCLC) for Prediction of Chemotherapy Resistance

1\. EINLEITUNG 1 1.1. Tumor-Modell nach Hanahan und Weinberg 1 1.2. Epidemiologie und Risikofaktoren des Bronchialkarzinoms 4 1.3. Histologie des Bronchialkarzinoms 5 1.4. Therapie des Bronchialkarzinoms 7 1.4.1. Klassische Therapien 8 1.4.2. Zielgerichtete Therapien 10 1.4.2.1. EGFR Inhibitoren 11 1.4.2.1.1. Monoklonale Antikörper gegen EGFR 11 1.4.2.1.2. Tyrosinkinase Inhibitoren gegen EGFR 12 1.4.2.1.3. Erworbene Resistenzen gegenüber EGFR Inhibitoren 14 1.4.2.2. EML4-ALK Inhibitoren 15 1.5. Molekulargenetik des Bronchialkarzinoms 16 1.5.1. Aktivierung von Onkogenen 17 1.5.1.1. Aktivierende Mutationen des Onkogens KRAS 18 1.5.1.2. Genetische Veränderungen des Onkogens EGFR 19 1.5.1.3. Aktivierung des Fusiongens EML4-ALK 20 1.5.1.4. Weitere Onkogene mit einer geringen Mutationsfrequenz 21 1.5.2. Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen 22 1.5.2.1. Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 22 1.5.3. Angiogenese und die Tumor(mikro)umgebung 24 1.6. Genetische Prädisposition für das Bronchialkarzinom 24 1.7. Hochdurchsatz-Sequenzierungs- Technologien 25 1.7.1. Genomweite Sequenzierung des Bronchialkarzinoms 26 1.8. Mausmodelle 27 1.8.1. Gentechnisch veränderte Mausmodelle 28 1.8.2. Xenograft- Modelle 29 1.8.3. Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle des Nicht- kleinzelligen Bronchialkarzinoms 30 1.9. PREDICT – Ein systembiologischer Ansatz zur prä-klinischen Krebsforschung 31 2\. ZIELSETZUNG 33 3\. MATERIAL UND METHODEN 35 3.1. Materialien 35 3.1.1. Material und Geräte 35 3.1.2. Chemikalien 37 3.1.3. Verwendete Puffer und Lösungen 39 3.1.4. Verwendete Kits 40 3.1.5. Verwendete Protein- und DNA-Marker 41 3.1.6. Verwendete Enzyme 41 3.1.7. Verwendete Medien 41 3.1.7.1. Bakterienmedien 41 3.1.7.2. Zellkulturmedien 42 3.1.8. Bakterienstämme 42 3.1.9. Humane Zelllinien 42 3.1.10. Oligonukleotide 43 3.1.11. Vektoren 43 3.1.12. Antikörper 46 3.1.13. siRNA Moleküle 46 3.1.14. Behandlung der Zellen mit zytotoxischen Agenzien 46 3.2. Methoden 47 3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 47 3.2.2. Zielgerichtete Mutagenese 48 3.2.3. Aufreinigung von PCR-Amplifikaten und DNA- Fragmenten aus einem präparativen Agarosegel 48 3.2.4. Enzymatische Restriktion von DNA 49 3.2.5. Ligation 49 3.2.6. Transformation von Escherichia coli 49 3.2.7. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. Coli 49 3.2.8. Bestimmung der DNA-bzw. RNA-Konzentration 50 3.2.9. Agarosegelelektrophorese 51 3.2.10. Sanger Sequenzierung 51 3.2.11. Lagerung von kryokonservierten humanen Zelllinien 51 3.2.12. Auftauen von kryokonservierten humanen Zelllinien 51 3.2.13. Kultivierung von humanen Zelllinien 52 3.2.14. Transfektion humaner Zelllinien mit Plasmid-DNA 52 3.2.15. Zelllyse von humanen Zelllinien 53 3.2.16. Transfektion mit siRNA Molekülen 53 3.2.17. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 54 3.2.18. Proteintransfer auf eine Membran (Western-Blot) 55 3.2.19. Immunnachweis von Proteinen 55 3.2.20. RNA Aufreinigung 55 3.2.21. Herstellung einzelsträngiger cDNA 56 3.2.22. Quantitative Echtzeit PCR (q-PCR) 56 3.2.23. Luziferase-Reporterexperimente 57 3.2.24. Zellproliferationsexperimente 58 3.2.24.1. Bestimmung der Proliferation mittels AlamarBlue®-Reagenz 58 3.2.24.2. Bestimmung der Proliferation mittels Hochdurchsatz-Mikroskopie 58 3.2.25. Patientenproben 59 3.2.25.1. IMGUS-Projekt 59 3.2.25.2. PREDICT-Projekt 59 3.2.25.3. Analyse der Einzelnukleotidvarianten mit der Affymetrix SNP-Array Technologie 60 3.2.26. Agilent SureSelect Anreicherungssystem 61 3.2.26.1. Präparation der DNA- Bibliothek für die Illumina-Sequenzierung 61 3.2.26.2. Präparation der DNA- Bibliothek für die SOLiD-Sequenzierung 63 3.2.27. Hybridisierung der DNA- Bibliothek 65 3.2.27.1. Quantifizierung der DNA-Hybrid-Bibliothek 66 3.2.28. Illumina –Sequenzierung 67 3.2.29. SOLiD-Sequenzierung 67 3.2.30. Prozessierung der Illumina-Sequenzierdaten 68 3.2.30.1. Analyse der Einzelnukleotidvarianten 68 3.2.30.2. Analyse der somatischen Kopienzahlvarianten 68 3.2.31. Prozessierung der SOLiD-Sequenzierdaten 69 3.2.31.1. Analyse der Einzelnukleotidvarianten 69 3.2.31.2. Analyse der somatischen Kopienzahlvarianten 69 3.2.32. Validierung der Mutationen mittels Massen-Spektrometrie 69 4\. ERGEBNISSE 72 4.1. Etablierung der Hochdurchsatz- Squenzierungs-Technologie für klinisches Gewebematerial 74 4.1.1. FFPE-Gewebe kann für die SureSelect zielgerichtete DNA Anreicherung mit anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung genutzt werden 74 4.1.2. Zielgerichtete DNA- Anreicherungs-Technologien sind geeignet für geringe DNA-Mengen 79 4.1.3. Unterschiedliche Biopsien eines Tumors weisen ein identisches somatisches SNV- Profil, aber unterschiedliche Kopienzahl-Profile auf 83 4.2. Klinische Daten der Patienten 87 4.3. Zielgerichtete Anreicherung genomischer Regionen mit anschließender Hochdurchsatz- Sequenzierung 88 4.3.1. Gesamt-Exom- Sequenzierung von zwei Patienten mit Normal Tumor- und Xenograft Gewebe 88 4.3.2. Sequenzierung der Anwender-definierten Zielregionen (9Mb) von 21 Patienten mit Normal- und Xenograft-Gewebe 91 4.3.3. Statistik der detektierten Einzelnukleotidvarianten 93 4.4. Validierung somatischer Mutationen mit der Massen-Spektrometrie-Technologie 94 4.5. Berechnung der Konkordanz zwischen dem Xenograft- und Primärtumorgewebe 96 4.6. Detektierung der somatischen- sowie der Keimbahn-Mutationen für 23 Patienten 100 4.6.1. Mutationsstatistik der Gesamt-Exom-Sequenzierung 100 4.6.2. Mutationsstatistik der 9Mb-Sequenzierung von 21 Patienten 102 4.6.3. Analyse der durch Mutationen betroffenen Signalwege 106 4.7. Stratifizierung der Mutationsprofile der einzelnen Xenografts nach der Sensitivität gegenüber den eingesetzten Chemotherapien 108 4.7.1. Ergebnisse für das Zytostatikum Carboplatin 109 4.7.1.1. Analyse der Gene mit somatischen Mutationen 111 4.7.1.1.1. Zellproliferationsexperimente 113 4.7.1.2. Analyse der Gene mit Keimbahnmutationen 114 4.7.2. Ergebnisse für das Zytostatikum Gemcitabin 115 4.7.2.1. Analyse der Gene mit somatischen Mutationen 118 4.7.2.1.1. Zellproliferationsexperimente 119 4.7.2.2. Analyse der Gene mit Keimbahnmutationen 120 4.7.3. Ergebnisse für das Zytostatikum Paclitaxel 121 4.7.3.1. Analyse der Gene mit somatischen Mutationen 123 4.7.3.2. Analyse der Gene mit Keimbahnmutationen 124 4.7.4. Ergebnisse für den EGFR Inhibitor Cetuximab 124 4.7.4.1. Analyse der Gene mit somatischen Mutationen 126 4.7.4.1.1. Zellproliferationsexperimente 129 4.7.4.2. Analysen der Gene mit Keimbahnmutationen 130 4.7.4.3. KMT2D Analyse unter Verwendung der Mutationsdaten, Expressionsdaten und Methylom-Daten 132 5\. DISKUSSION 137 5.1. Etablierung der Hochdurchsatz-Sequenzierungs-Technologie für klinische Gewebematerial 137 5.2. Genetische Veränderungen des Androgen Rezeptor- Signalweg in Prostatatumoren 140 5.3. Berechnung der Konkordanz zwischen Xenograft- und Primärtumorgewebe 143 5.4. Statistik der detektierten Einzelnukleotidvarianten 145 5.5. Zielgerichtete Anreicherung genomischer Regionen mit anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung von 23 Patienten- abgeleiteten Xenograft-Modellen und dem korrespondierenden primären Normalgewebe 146 5.5.1. Validierung somatischer Mutationen mit der Massen- Spektrometrie-Technologie 148 5.5.2. Einblick in die biologische Relevanz der identifizierten Genkandidaten mit somatischen und Keimbahnmutationen 149 5.6. Stratifizierung der Mutationsprofile der einzelnen Xenografts nach der Sensitivität gegenüber den eingesetzten Chemotherapien 151 5.6.1. Carboplatin 151 5.6.2. Gemcitabin 156 5.6.3. Paclitaxel 159 5.6.4. Cetuximab 160 5.7. Erster Versuch eines systembiologischen Ansatzes zur Voraussage der Wirkung von Cetuximab 165 6\. AUSBLICK 167 7\. ZUSAMMENFASSUNG 168 8\. SUMMARY 170 9\. LITERATURVERZEICHNIS 172 PUBLIKATIONEN 187 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 191 ANHANG 195Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden somatische- und Keimbahnmutationen bei Bronchialkarzinom-Patienten identifiziert, die möglicherweise für eine Chemotherapie-Resistenz der Patienten verantwortlich sind. Dazu wurden Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle und das primäre Normalgewebe von 23 Nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom-Patienten verwendet, und das jeweilige Mutationsprofil durch zielgerichtete Hochdurchsatz- Sequenzierung generiert. Hierfür war es zunächst erforderlich, die Technologien für klinisches Gewebematerial zu etablieren. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, dass sowohl Gefriermaterial als auch in Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe für die zielgerichtete Anreicherung und Sequenzierung verwendet werden können. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass eine geringe DNA-Menge ausreicht, um eine gute Sequenzierungs- und Anreicherungseffizienz zu erhalten. Unterschiedliche Biopsien eines Primärtumors besitzen ein identisches Profil der Einzelnukleotidvarianten. Bei Analysen der Kopienzahlvarianten muss aber die Tumorheterogenität von unterschiedlichen Biopsien beachtet werden. Die Ergebnisse der Mutationsanalyse der Xenografts bestätigten die hohe Mutationsfrequenz, die dem Bronchialkarzinom zugrunde liegt. Bezugnehmend auf die somatischen Mutationen und die somatischen Kopienzahlvarianten konnte eine hohe Übereinstimmung zwischen dem Xenograft-Tumor und dem Primärtumor erzielt und dadurch bestätigt werden, dass Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle für die Mutationsanalyse verwendet werden können. Anhand von Sensitivitätstests der 23 Xenograft-Modelle auf unterschiedliche Chemotherapien wie Carboplatin, Gemcitabin, Paclitaxel und Cetuximab konnten Mutationen identifiziert werden, die vermutlich für intrinsische Resistenzen verantwortlich sind. Unter anderem konnten biologische Prozesse und Genkandidaten aufgezeigt werden, die bisher mit noch keinem intrinsischen Resistenzmechanismus assoziiert wurden. Beispielsweise wurden in dem p21-aktivierenden (PAK)-Signalweg signifikant viele somatische Mutationen in den Carboplatin-resistenten Tumoren identifiziert. Bezüglich einer Gemcitabin-Resistenz wurden in den Tumoren u. a. viele Mutationen in dem FGFR-Signalweg identifiziert, die mit einer verringerten Sensitivität gegen das Therapeutikum assoziiert sind. Für beide Signalwege existieren Inhibitoren, die nun untersucht werden sollten, ob sie eine Carboplatin- bzw. Gemcitabin-Resistenz aufheben können. Hinsichtlich einer Resistenz gegenüber dem EGFR Inhibitor Cetuximab konnten u. a. das Hitzeschockprotein HSP90AB1 und der Wachstumsfaktor HGF als sehr interessante Genkandidaten identifiziert werden, die in einem Zusammenhang mit Chemotherapie-Resistenzen gebracht werden können. Funktionelle Experimente ergaben Hinweise darauf, dass MAML2, CDC42BPA und KMT2D einen Einfluss auf die Sensitivität gegenüber dem EGFR Inhibitor Cetuximab haben könnten. Abschließend erfolgte eine erste Integration unterschiedlicher Datensätze, um Auswirkungen der identifizierten KMT2D Mutationen zu ermitteln. Interessanterweise zeigten Tumore mit Mutationen im KMT2D Gen, das für eine Histon-Methyltransferase kodiert, signifikante Veränderungen der Genexpression und der DNA-Methylierung, die mit der Chemotherapie-Resistenz in Verbindung gebracht werden können. Schlussendlich wurden die generierten Datensätze in ein mathematisches Vorhersagemodell implementiert, um in einem ersten systembiologischen Ansatz eine Vorhersage zur Wirkstoffwirkung zu ermöglichen. Hierbei zeigten erste Ergebnisse von zwei Tumoren eine sehr gute Übereinstimmung der Sensitivität der Xenograft-Mäuse und der in silico Vorhersage der Wirksamkeit von Cetuximab. Die Modellierung soll nun auch für die weiteren 21 Patienten, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht worden sind, durchgeführt werden. Falls für diese ebenfalls eine gute Übereinstimmung zwischen den experimentellen Daten und den in silico Modellierungen existieren sollte, hätte dies zweifellos weitreichende Konsequenzen für die zukünftige Therapie von Patienten mit Nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom.In this thesis, the mutation profile of somatic- and germline mutations of 23 patient-derived xenograft-models and the corresponding normal tissues of non- small-cell lung cancer patients were generated. For this, a customer target high throughput re-sequencing approach was used. However, these technologies needed to be further improved with regard to reproducibility and applicability to clinical samles and settings. It could be shown that formalin-fixed paraffin embedded tissue material can supplement fresh frozen tissues for the detection of single nucleotide variants and that solution-based enrichment experiments can be accomplished with small amounts of DNA. Finally, the question was to addressed whether the heterogeneity of a tumor is reflected by different genetic alterations, e.g. if different foci of a tumor display different genomic patterns. It could be shown that the tumor heterogeneity plays an important role mainly for the detection of copy number alterations. The results of the mutation analysis confirmed the high mutation rates that underlie lung cancer diseases. As a technical proof-of-principle experiment it could be shown that somatic mutations and somatic copy number alterations depicted a high overlap between the xenograft-tumor and the primary tumor and confirmed that patient-derived xenograft-models can be used for genetic analysis. Sensitivity tests for 23 xenografts-models were performed for different chemotherapies like Carboplatin, Gemcitabine, Paclitaxel, and Cetuximab. For these, mutations could be identified which might be responsible for intrinsic resistances. For example, the p21-activated (PAK) signaling pathway was significantly affected by somatic mutations in Carboplatin resistant tumors. In regard to Gemcitabine, many mutations within the FGFR signaling pathway were associated with a reduced sensitivity of the mice. Concerning a resistance for the EGFR inhibitor Cetuximab, the heat shock protein HSP90AB1 and the hepatocyte growth factor HGF could be identified as gene candidates transmitting a chemotherapy resistance. Functional assays were performed which provide first evidence that MAML2, CDC42BPA and KMT2D are involved in the resistance to the EGFR inhibitor Cetuximab. Since KMT2D is a histone methyltransferase, a data integration approach was used to identify its functional relevance. Interestingly, for resistant tumors with KMT2D mutations significant changes in gene expression and DNA methylation were measured. In the end, the generated datasets were integrated in a computer prediction tool (PyBios) with the aim to establish a systems biology network for therapy responses. First preliminary results in two tumors confirmed a high concordance between the chemotherapy sensitivity of the xenografts mice and in silico prediction. These modelling will now be extended to the 21 patients analyzed in this thesis. In case that the experimental data and the in silico modelling remains with a high concordance (high predictive value for the in silico modelling) this approach will have without doubt, an important consequence for the therapy of patients with non-small-cell lung cancer in the future

Schematic model of FOX-2 and ATXN1 effects on ATXN2 transcript.

<p>The <i>SCA2</i> gene bears two putative FOX-binding sites downstream of exon 18 in the ATXN2 transcript as illustrated. Under normal conditions, FOX-2 binding resulted in inclusion of exon 18, whereas depletion of FOX-2 or overexpression of ATXN1 resulted in increased levels of ATXN2 transcripts lacking exon 18.</p

Co-localization of FOX-2 with nuclear ATXN1 inclusions is independent of the polyglutamine region.

<p>Confocal microscopy of HeLa cells transfected with CFP-ATXN1-Q0, CFP-ATXN1-Q30 or CFP-ATXN1-Q82, respectively. Forty-eight hours post transfection cells were fixed and prepared for microscopic analyses. FOX-2 protein was visualized using a specific antibody (Abnova). CFP fluorescence was pseudo-coloured green. Nuclei were stained using Hoechst. Bars represent 20 µm.</p

ATXN1 interacts with FOX-2 splice variants.

<p>(<b>A</b>) Schematic view of ATXN1 and the regions used in the Y2H analyses (left) and FOX-2 variants (right). Prey plasmids pACT-ATXN1-NTQ30 or pACT-ATXN1-NTQ82 cover amino acids 1–576, pACT-ATXN1-AXH amino acids 559–701, and pACT-ATXN1-CT amino acids 530–816. Bait plasmid pBTM-FOX-2_V1 covers amino acids 1–380 of variant 1, including the putative NLS in the C-terminal region, and pBTM-FOX-2_cyt covers amino acids 1–391 of the cytoplasmic FOX-2 variant. Different C-terminal regions of both FOX-2 variants are highlighted in blue and green. (<b>B; C</b>) For directed Y2H analyses yeast strain L40ccua was co-transformed with the relevant bait and prey plasmids, and transformants were selected and spotted onto selective media or membrane to analyze activity of the reporter genes. (<b>D</b>) For Co-IP experiments, HEK293T cell lysates derived from cells overexpressing FLAG-ATXN1-Q30 (left panel) or HEK293T cell lysates (right panel) were incubated with an antibody directed against FOX-2 (Bethyl or Abnova, respectively). Cell lysates incubated without primary antibody served as controls. Then, membranes were treated with an antibody directed against the FLAG tag or ATXN1 to detect precipitated protein.</p

The FOX-2 splice variants FOX-2_V1 and FOX-2_cyt co-localize with nuclear ATXN1 inclusions.

<p>Confocal microscopy of HeLa cells transfected with (<b>A</b>) pCMV-HA-FOX-2_V1 and pcDNA1-FLAG-SCA1-Q30 or pcDNA1-FLAG-SCA1-Q82, or (<b>B</b>) pCMV-MYC-FOX-2_cyt and pcDNA1-FLAG-SCA1-Q30 or pcDNA1-FLAG-SCA1-Q82, and (<b>C</b>) pCMV-MYC-TIAR and pcDNA1-FLAG-SCA1-Q30 or pcDNA1-FLAG-SCA1-Q82, respectively. Forty-eight hours post transfection cells were fixed and prepared for microscopic analyses. Proteins were visualized using the respective antibodies against the tag as described in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0037985#s4" target="_blank">Material and Methods</a>. Nuclei were stained using Hoechst. Bars represent 20 µm.</p

FOX-2 co-localizes with nuclear ATXN1 inclusions.

<p>(<b>A</b>) Endogenous localization of FOX-2 in HeLa cells visualized with an antibody directed against FOX-2 (Bethyl). (<b>B; C</b>) HeLa cells expressing normal and mutant ATXN1 were fixed forty-eight hours post transfection. Endogenous proteins were visualized using respective antibodies against (<b>B</b>) FOX-2 (Bethyl) and FLAG or (<b>C</b>) TIAR and FLAG as described. Nuclei were stained using Hoechst. Bars represent 20 µm.</p