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Gas-phase microsolvation of ubiquitin: investigation of crown ether complexation sites using ion mobility-mass spectrometry.
In this study the gas-phase structure of ubiquitin and its lysine-to-arginine mutants was investigated using ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) and electron transfer dissociation-mass spectrometry (ETD-MS). Crown ether molecules were attached to positive charge sites of the proteins and the resulting non-covalent complexes were analysed. Collision induced dissociation (CID) experiments revealed relative energy differences between the wild type and the mutant crown-ether complexes. ETD-MS experiments were performed to identify the crown ether binding sites. Although not all of the binding sites could be revealed, the data confirm that the first crown ether is able to bind to the N-terminus. IM-MS experiments show a more compact structure for specific charge states of wild type ubiquitin when crown ethers are attached. However, data on ubiquitin mutants reveal that only specific lysine residues contribute to the effect of charge microsolvation. A compaction is only observed for one of the investigated mutants, in which the lysine has no proximate interaction partner. On the other hand when the lysine residues are involved in salt bridges, attachment of crown ethers has little effect on the structure
Untersuchung von Protein-Ligand Komplexen mittels nativer Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsmassenspektrometrie
Intermolecular interactions of proteins with each other or with other
molecules play a key role in all processes in living organisms. Therefore,
proteins represent important therapeutic targets and their structural
elucidation is essential for the development of new drugs. Native mass
spectrometry (MS) is an attractive tool for the investigation of proteins and
their complexes. Molecules are ionized gently and transferred from solution
into the gas phase with the aim to maintain inter- and intramolecular non-
covalent interactions and the three-dimensional structure. By measuring the
mass-to-charge ratio of the ionic species, information on mass, charge, and
stoichiometry can be obtained. Native MS is readily compatible with other gas-
phase techniques, such as ion mobility spectrometry (IMS) and the combination
of both methods, so-called ion mobility-mass spectrometry (IM-MS), provides
further structural information on the overall size and shape of a molecule. In
this thesis, protein-ligand complexes were investigated using native MS and
IM-MS with the aim of evaluating their potential for application in high-
throughput analysis for drug discovery. First, native MS was used to elucidate
the influence of the standard solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) on the protein
gas-phase structure and protein-ligand affinity. It was shown that the protein
charge-state distribution and likely the gas-phase structure is altered
depending on the DMSO concentration. In addition, the protein-ligand affinity
decreased with increasing DMSO levels. In a second study, the potential of
native MS for fragment-based drug discovery was evaluated. This approach is
based on the screening of small molecular fragments against a target and
promises higher hit rates and smaller library sizes compared to standard high-
throughput screening. Data on four protein systems showed that native MS
currently presents a medium- to low-throughput method but can provide valuable
insights into protein-ligand interactions that are inaccessible by other
techniques. In combination with IMS, the influence of a protein’s
microenvironment on its gas-phase structure was investigated. To do so, crown-
ether molecules were attached non-covalently to microsolvate positively
charged protein side chains, preventing them from collapsing onto the protein
backbone. Using tandem MS and IM-MS, the crown-ether binding sites were
identified and it was shown that specific side chains stabilize the gas-phase
structure even without crown-ether binding. In the last study, IM-MS was
successfully tested as a tool for conformational screening of protein-peptide
complexes. Only subtle structural differences between the complexes were
observed, and a further investigation by collision-induced unfolding and
collision-induced dissociation displayed differences in complex stability and
unfolding behavior. In summary, native MS and IM-MS are valuable tools for the
characterization of protein-ligand interactions. Currently, the methods are
limited to a small number of samples, but ongoing developments promise a
decisive role in drug discovery in the near future.Intermolekulare Wechselwirkungen von Proteinen untereinander oder mit anderen
Molekülen, nehmen eine Schlüsselrolle in allen Prozessen lebender Organismen
ein. Aus diesem Grund stellen Proteine wichtige therapeutische Angriffspunkte
(Targets) dar und ihre strukturelle Aufklärung ist essenziell für die
Entwicklung neuer Wirkstoffe. Native Massenspektrometrie (MS) ist ein
attraktives Werkzeug, um Proteine und deren Komplexe zu untersuchen. Moleküle
werden sanft ionisiert und aus der Lösung in die Gasphase überführt mit dem
Ziel, inter- und intramolekulare Wechselwirkungen und die dreidimensionale
Struktur aufrechtzuerhalten. Die ionischen Spezies werden durch ihr Masse-zu-
Ladungsverhältnis detektiert, was zu Informationen über Masse, Ladung und
Stöchiometrie führt. Native MS ist mit anderen Gasphasentechniken, wie
Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS), gut kompatibel und die Kombination beider
Methoden zu Ionenmobilitätsmassenspektrometrie (IM-MS) liefert weitere
strukturelle Informationen über die Größe und Form eines Moleküls. In dieser
Arbeit wurden Protein-Ligandkomplexe mittels nativer MS und nativer IM-MS mit
dem Ziel untersucht, sie hinsichtlich ihres Potentials für die
Hochdurchsatzanalyse der Wirkstoffentwicklung zu bewerten. Zuerst wurde native
MS eingesetzt, um den Einfluss des Standardlösungsmittels Dimethylsulfoxid
(DMSO) auf die Proteingasphasenstruktur, sowie die Protein-Ligandaffinität zu
analysieren. Es wurde gezeigt, dass sich je nach DMSO Konzentration in der
Probe die Ladungszustandsverteilung und somit vermutlich auch die
Gasphasenstruktur eines Proteins ändert. Weiterhin verringerte sich die
Affinität des Liganden mit steigender DMSO Konzentration. In einer zweiten
Studie wurde das Potential von nativer MS für die fragmentbasierte
Wirkstoffentwicklung getestet. In diesem Ansatz werden kleine Molekülfragmente
gegen ein Target gescreent, wodurch im Vergleich zum Standard-
hochdurchsatzverfahren höhere Erfolgsraten bei gleichzeitig geringerer
Probenanzahl möglich sind. Ergebnisse von vier getesteten Targetproteinen
zeigten, dass native MS im Moment noch keinen großen Durchsatz erlaubt, jedoch
wichtige Einblicke in Protein-Ligandkomplexe liefern kann, welche durch andere
Methoden nicht ohne Weiteres zugänglich sind. In einer weiteren Studie wurde
in Kombination mit IMS der Einfluss der unmittelbaren Proteinumgebung auf
dessen Gasphasenstruktur untersucht. Dafür wurden Kronenether-moleküle
nichtkovalent gebunden, um positiv geladene Seitenketten zu mikrosolvatisieren
und sie dadurch vor einem Zurückfalten auf das Proteinrückgrat zu bewahren.
Mit Hilfe von Tandem MS und IM-MS wurden Bindungsstellen der Kronenether
identifiziert und darüber hinaus gezeigt, dass bestimmte Proteinseitenketten
die Gasphasenstruktur auch ohne Bindung von Kronenether stabilisieren können.
In der letzten Studie wurde IM-MS erfolgreich als Methode zum
Konformationsscreening von Protein-Peptidkomplexen eingesetzt. Die Komplexe
zeigten nur geringe strukturelle Unterschiede, weshalb sie mittels kollisions-
induzierter Entfaltung und Dissoziation weiter untersucht und ihre
Unterschiede in Stabilität und Entfaltungsverhalten analysiert wurden.
Zusammenfassend stellen native MS und IM-MS wertvolle Werkzeuge zur
Charakterisierung von Protein-Ligandwechselwirkungen dar. Gegenwärtig sind die
Methoden zwar noch nicht für eine große Probenanzahl geeignet, aber durch
ständige Entwicklungen werden sie in naher Zukunft sicherlich eine
bedeutendere Rolle im Prozess des Wirkstoff-designs einnehmen können