Bimodal antagonism of PKA signalling by ARHGAP36

Protein kinase A is a key mediator of cAMP signalling downstream of G-protein-coupled receptors, a signalling pathway conserved in all eukaryotes. cAMP binding to the regulatory subunits (PKAR) relieves their inhibition of the catalytic subunits (PKAC). Here we report that ARHGAP36 combines two distinct inhibitory mechanisms to antagonise PKA signalling. First, it blocks PKAC activity via a pseudosubstrate motif, akin to the mechanism employed by the protein kinase inhibitor proteins. Second, it targets PKAC for rapid ubiquitin-mediated lysosomal degradation, a pathway usually reserved for transmembrane receptors. ARHGAP36 thus dampens the sensitivity of cells to cAMP. We show that PKA inhibition by ARHGAP36 promotes derepression of the Hedgehog signalling pathway, thereby providing a simple rationale for the upregulation of ARHGAP36 in medulloblastoma. Our work reveals a new layer of PKA regulation that may play an important role in development and disease

Die Herkunft und Entwicklung von Makrogliazellen des Kleinhirns

Abstract 1st project: The origin of cerebellar oligodendroglia While the origin of oligodendroglia in the prosencephalon and the spinal cord has been extensively studied and accurately described, the origin of this cell type in the cerebellum is largely unknown. In order to investigate the site where cerebellar oligodendrocytes originate and what migratory pathways they follow to reach their final destination in the adult, in ovo transplants were performed using the quail/ chick chimeric system. The chimeric embryos were developed up to HH43-49 (17-19 days of incubation) to map the location of donor cells and analyze their phenotype by immunohistochemistry. As a result, mesencephalic homotopic and homochronic transplants generated cellular migratory streams moving from the grafted epithelium into the host cerebellum, crossing the isthmus mainly through the velum medullare and invading the central white matter. From here, these mesencephalic cells invaded all the layers of the cerebellar cortex except the external granule layer. The majority of the cells were detected in the central and folial white matter, as well as in superficial regions of the internal granule layer, surrounding the Purkinje cells. In the latter case, the donor cells presented a Bergmann glial morphology and were Vimentin positive, while in other areas they were PLP and Olig2-positive, indicating an oligodendroglial fate. The combinatory analysis of the different grafts allowed us to propose the fate map of chick cerebellar oligodendroglia at the neural tube stage. As a result, the majority of the cerebellar oligodendrocytes originate from the parabasal plate of the mesencephalon. 2nd project: Gdf10 in the development of cerebellar Bergmann glia Growth differentiation factor 10 (Gdf10), also known as Bmp3b, is a member of the transforming growth factor beta (TGF-ß)- superfamily. Gdf10 is expressed in Bergmann glial cells, which was investigated by single- cell transcriptional profiling (Koirala and Corfas 2010). In order to create a basis for further studies, the expression pattern of Gdf10 mRNA was characterized between E14.5 and P28 in mice. At embryonic stages, the expression pattern varied along the antero-posterior axis of the cerebellum. Anteriorly Gdf10+ cells were detected along the ventricular zone (VZ) of the developing vermis, following the dorsal cerebellar midline, whereas in the cerebellar hemispheres Gdf10 was expressed both in the rhombic lip and the neighboring ventricular epithelium. Posteriorly, Gdf10 expression labeled the entire cerebellar rhombic lip and ventricular zone of the 4th ventricle. Furthermore, Gdf10 expression was detected in the intermediate zone and close to the developing external granule cell layer (EGL). A detailed coexpression analysis of Gdf10 with prominent glial markers such as GFAP, Nestin, GLAST and Vimentin was performed to investigate the expression at different time points. From these results and the analysis of the expression pattern we concluded that Gdf10 most likely induces the transition from radial glia to Bergmann glia development and is a promising marker to follow Bergmann glial cell development. The analysis of Gdf10 and Nestin expression revealed two modes of migration. First, a well characterized radial migration from the medial ventricular zone, as well as a primarily radial migration, which finally undergoes a perpendicular turn towards the EGL. The latter was only observed in the posterior cerebellum. To investigate a possible mechanism regulating Gdf10 in cerebellar development, Gdf10 expression was analyzed in conditional mutants of Shh. We found that Gdf10, even though differentially expressed, is not regulated by Shh. The screening for transcription factor binding sites revealed possible regulators of Gdf10.Zusammenfassung Projekt 1: Herkunft von Oligodendrogliazellen des Kleinhirns Die Herkunft von Oligodendrogliazellen des Vorderhirns und Rückenmarks wurde in den letzten Jahren intensiv studiert und analysiert. Die Herkunft von Oligodendrogliazellen des Kleinhirns ist hingegen weitgehend unbekannt. Um den Ursprung und den entsprechenden Migrationsweg genauer zu bestimmen, wurde in ovo das Mittelhirn von Wachtelembryonen entlang der rostro- caudalen und dorso- ventralen Achse in Hühnerembryos transplantiert. Im Anschluss wurden die Chimären bis zum Alter von 19 Tagen inkubiert (Hamburger Hamilton- Stadium 45/ HH45). Sowohl der Ursprung des Transplantats als auch die Wanderung wurden kartiert und der Phänotyp immunhistologisch analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass homotopische und homochrone Transplantate des Mittelhirns Zellen generieren, die vom Transplantat über das Marksegel (velum medullare) in das ventrale Kleinhirnmark wandern. Die Spenderzellen wanderten durch das Kleinhirnmark in alle Schichten des Kleinhirns, mit Ausnahme der externen Körnerschicht. In der Purkinjezellschicht exprimierten diese Zellen Vimentin mit der typischen Struktur von Bergmann Glia. In den anderen Schichten und insbesondere im Kleinhirnmark konnten PLP und Olig2 als Marker für Oligodendrozytenschicksal nachgewiesen werden. Die eingehende Analyse einer Vielzahl von Transplantaten erlaubte es, den Ursprung dieser Zellen zu kartieren und auf die parabasale Platte des Mittelhirns einzugrenzen. Projekt 2: Expressions- und Funktionsanalyse des Wachstums- und Differenzierungsfaktors Gdf10 im Kleinhirn Gdf10/ Bmp3b gehört zur TGF-ß- Familie und ist in Bergmann Gliazellen exprimiert. Dies wurde mittels „single- cell transcriptional profiling“ herausgefunden (Koirala and Corfas 2010). Um eine Basis für weiterführende Studien zur Funktion von Gdf10 zu entwickeln, wurde die Expression im Kleinhirn genauer charakterisiert. Hierzu wurden in situ Hybridisierungen in Mäusen von E14,5 bis zum adulten Stadium durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Gdf10 sowohl im embryonalen als auch im adulten Stadium exprimiert ist. Embryonal variierte die Expression entlang der rostro- caudalen Achse zwischen lateralem und medialem Kleinhirn. Im rostralen Kleinhirn wurde Gdf10 vor allem in der sich entwickelnden Vermis detektiert, in der lateralen Ventrikulärzone, die unmittelbar an die intraventrikuläre Rautenlippe grenzt, sowie in der interventrikulären Rautenlippe selbst. Im caudalen Kleinhirn hingegen, wurde Gdf10 in allen Zonen des Kleinhirns exprimiert, welches die intraventrikuläre Rautenlippe, die Ventrikulärzone und die Intermediärzone einschließt. Die Expression im medialen Kleinhirn dehnte sich radiär aus, während im lateralen Kleinhirn nur tangential eine Ausweitung unterhalb der externen Körnerschicht beobachtet wurde. Postnatal wurde Gdf10 vorranging in der Purkinjezellschicht lokalisiert. Diese Expression war stabil bis ins adulte Stadium. Aus der detaillierten Charakterisierung von Gdf10+ Zellen mit Gliazellmarkern und der Analyse des Expressionsmusters kann geschlussfolgert werden, dass Gdf10 ab dem Übergang vom Stadium der radialen Gliazellen in Bergmann Gliazellen bis ins adulte Stadium in diesem Zelltyp vorhanden ist. Gdf10 ist daher ein spezifischer Marker zur Verfolgung der Genese, Migration und terminalen Differenzierung von Bergmann Glia. Weiterhin wurden bei der Untersuchung der Expression von Gdf10 und Nestin zwei Migrationsmodi entdeckt. Zum einen eine bereits langjährig bekannte radiäre Migration, ausgehend von der Ventrikulärzone, und zum anderen eine primär radiäre Migration, die in der finalen Phase in einer 90° Biegung in Richtung der externen Körnerschicht endet. Diese Art der Migration wurde ausschließlich im caudalen Kleinhirn beobachtet und erklärt die vermeintlich tangentiale Ausweitung der Gdf10 Expression. Des Weiteren wurde untersucht, ob Gdf10 von sonic hedgehog (Shh) reguliert wird, welches in Purkinjezellen des Kleinhirns exprimiert ist. Dazu wurde die Gdf10- Expression in Kleinhirnen von konditionellen Shh- defizienten Mäusen geprüft. Die persistierende Gdf10 Expression in diesen Mäusen schließt eine direkte Regulierung durch Shh aus. Eine in silico Analyse von Gdf10 auf Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktoren, zeigte eine Reihe weiterer möglicher Gene, die in die Regulation der Gdf10 Expression involviert sein könnten

Cerebellar oligodendroglial cells have a mesencephalic origin

While the origin of oligodendroglia in the prosencephalon and spinal cord has been extensively studied and accurately described, the origin of this cell type in the cerebellum is largely unknown. To investigate where cerebellar oligodendrocytes generate and which migratory pathways they follow to reach their final destination in the adult, in ovo transplants were performed using the quail/chick chimeric system. The chimeric embryos were developed up to HH43-49 (17-19 days of incubation) to map the location of donor cells and analyze their phenotype by immunohistochemistry. As a result, mesencephalic homotopic and homochronic transplants generated cellular migratory streams moving from the grafted epithelium into the host cerebellum, crossing the isthmus mainly through the velum medullare and invading the central white matter. From here, these mesencephalic cells invaded all the layers of the cerebellar cortex except the granular layer. The majority of the cells were detected in the central and folial white matter, as well as in superficial regions of the internal granular layer, surrounding the Purkinje cells. In the latter case, the donor cells presented a Bergmann glial morphology and were Vimentin positive, while in other areas they were PLP and Olig2-positive, indicating an oligodendroglial fate. The combinatory analysis of the different grafts allowed us to propose the fate map of chick cerebellar oligodendroglia at the neural tube stage. As a result, the majority of the cerebellar oligodendrocytes originate from the parabasal plate of the mesencephalon. © 2011 Wiley-Liss, Inc.National grants: DIGESIC-MEC.BFU2008-00588, Ingenio 2010 MEC-CONSOLIDER.CSD2007-00023, GVA Prometeo 2009.028, ISCIII/CIBERSAM. RD06/0010/0023 and Tercel. RD06/0010/0023. International grants: ELA Foundation.2006-022I2 and EU LSHG-CT-2004-512003 to S.M.Peer Reviewe