Molecular mechanisms that regulate neurotransmission and establish presynaptic homeostasis at the Drosophila melanogaster neuromuscular junction

Accurate and efficient neurotransmission is achieved through a complex interplay of proteins and lipids at the presynaptic active zone (AZ). Action potentials (APs) trigger the fusion of synaptic vesicles (SVs) with the plasma membrane at AZs in a coordinated manner. The subsequent release of neurotransmitter (NT) into the synaptic cleft and activation of postsynaptic receptors elicits a response in the opposing cell. Synapses are plastic structures and this feature aids in modulating neurotransmission depending on the situational requirements. Plasticity is thought to form the basis of information processing including learning and memory and its dysregulation is linked to neurological disorder. This thesis presents work that explores the molecular contributions of AZ proteins and lipid signalling to neurotransmission and plasticity, using electrophysiology and microscopy at the Drosophila melanogaster larval neuromuscular junction (NMJ). In the first part of the thesis, the role of lipid signalling is investigated. The ability to load and activate an initially chemically caged PI(4,5)P2 is confirmed in mammalian cell culture, with observed changes in actin organisation. At the Drosophila NMJ, acutely uncaged PI(4,5)P2 provides a possible protective effect against decreasing responses to stimulation. PI(4,5)P2 is metabolised to diacylglycerol (DAG), and application of a functionally analogous phorbol ester (PMA) is also shown here to greatly enhance evoked but not spontaneous NT release. Neurotransmission during presynaptic homeostatic plasticity provides a primary focus for this thesis. This form of plasticity maintains stable neurotransmission in response to a reduction in postsynaptic NT sensitivity, induced rapidly by pharmacological application of a postsynaptic NT receptor antagonist or chronically by genetic deletion of the receptors. Functionally, presynaptic homeostatic potentiation (PHP) occurs as NT release increases to compensate for postsynaptic challenge. This is accompanied by structural reorganisation of AZs proteins, involving an increase in presynaptic protein levels. It is shown here that the SV priming factor and release site generating protein Unc13A is vital for rapid PHP, and the N-terminal portion of Unc13A is specifically identified as being essential for this process. Interestingly, the AZ cytomatrix scaffold protein Bruchpilot (BRP) is necessary for the structural aspect of homeostatic plasticity but is dispensable for functional PHP. However, following the long-term chronic induction of presynaptic homeostatic plasticity, BRP is found to be necessary for both functional PHP and structural AZ reorganisation. Additionally, axonal transport is required for both manifestations during long-term homeostatic plasticity. The results outline the similarities and differences between acutely and chronically induced presynaptic homeostatic plasticity and they suggest how core AZ proteins differentially regulate this process depending on the timescale. The disparity between the functional and structural components of homeostatic plasticity is unveiled, indicating that PHP does not necessarily require AZ structural change on short timescales, instead being important for consolidation of potentiation.Präzise und effiziente Neurotransmission wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Proteinen und Lipiden an der präsynaptischen aktiven Zone (AZ) erreicht. Aktionspotentiale (AP) lösen die koordinierte Fusion von synaptischen Vesikeln (SV) mit der Plasmamembran der AZ aus. Die anschließende Ausschüttung von Neurotransmittern (NT) in den synaptischen Spalt und die Aktivierung von postsynaptischen Rezeptoren löst eine Erregung der postsynaptischen Zelle aus. Die Eigenschaft von Synapsen, plastische Strukturen darzustellen, erlaubt die Modulation von Neurotransmission je nach bestehenden Anforderungen. Synaptische Plastizität wird als Grundlage für Informationsverarbeitung sowie für Lernen und Gedächtnisbildung angesehen. Ihre Dysregulierung wird mit neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Diese Arbeit befasst sich mit der Beteiligung von AZ Proteinen und Lipid-Signalkaskaden an Neurotransmission sowie synaptischer Plastizität, die mithilfe von Elektrophysiologie und Mikroskopie an der larvalen neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster untersucht wurde. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Rolle, die Lipide bei der Signalübertragung spielen, untersucht. Zunächst wird gezeigt, wie kultivierte Zellen mit einer anfangs durch einen chemischen „Käfig“ inaktivierten Form von PI(4,5)P2 geladen werden können. Es wird desweiteren verifiziert, dass diese Komponente aktiviert werden kann und dass dies zu Änderungen der Aktinorganisation führt. An der neuromuskulären Synapse von Drosophila wird zudem gezeigt, dass akut aktiviertes PI(4,5)P2 als möglicher Mechanismus zum Schutz gegen abnehmende Übertragungsstärke dient. PI(4,5)P2 wird zu Diacylglycerol (DAG) metabolisiert und es wird in dieser Arbeit demonstriert, dass sein Analogon Phorbolester (PMA) AP-induzierte postsynaptische Antwortstärke stark verändert, während es keinen Effekt auf spontane synaptische Aktivität hat. Neurotransmission im Kontext von präsynaptischer homöostatischer Plastizität (PHP) stellt den Hauptfokus dieser Dissertation dar. Im Zuge einer verringerten NT-Sensitivität von postsynaptischen Rezeptoren , die entweder durch pharmakologische Interferenz durch postsynaptische Rezeptorantagonisten oder den genetisch erzielten Verlust der Rezeptoren erzielt werden kann, stellt PHP eine beständige Neurotransmission sicher. Funktionell beinhaltet PHP eine Kompensation einer solchen postsynaptischen Herausforderung, die durch den Anstieg von freigesetztem NT durch die Präsynapse erzielt wird. Begleitet wird dies durch die strukturelle Umgestaltung von präsynaptischen Proteinen, was ihren Anstieg an der AZ beinhaltet. Das AZ Protein Unc13A spielt eine essentielle Rolle für die Vorbereitung der SV für ihre Fusion und wurde zudem als das Molekül identifiziert, das ihre Freisetzungsstelle definiert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Unc13A und im Spezifischen der N-terminale Teil des Proteins, unabdingbar für die funktionelle Komponente von PHP ist. Zwar ist das AZ Strukturprotein Bruchpilot (BRP) notwendig für den strukturellen Aspekt der PHP, interessanterweise ist es jedoch entbehrlich für funktionelle PHP. Im Zuge der chronischen Induktion von homeostatischer Plastizität hingegen, ist BRP sowohl für die funktionelle als auch für die strukturelle Komponente notwendig. Zudem wird axonaler Transport von synaptischem Material für beide Aspekte von PHP über längere Zeiträume gebraucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der schnellen und chronisch induzierten PHP einander gegenüber und skizzieren, wie Kernproteine an der AZ diesen Prozess in Abhängigkeit von seiner Zeitskala regulieren. Die Unterschiede zwischen den molekularen Komponenten der funktionellen und strukturellen PHP werden aufgedeckt und es werden Hinweise dafür aufgezeigt, dass PHP nicht zwingend die strukturelle Ummodellierung der AZ benötigt

Elizabeth Anscombe and an argument against contraception

In the 1960s, before the promulgation of Humanae Vitae, the Catholic philosophers Elizabeth Anscombe and Herbert McCabe OP debated whether there are convincing natural law arguments for the claim that contraception violates an exceptionless moral norm. This article revisits those arguments and critiques McCabe’s approach to natural law, concerned primarily with ‘social sin’ and not simply violations of ‘right reason,’ as one particularly ill-suited to addressing questions in sexual ethics and unable both to distinguish properly between certain forms of sexual wrongdoing and more obviously social sins such as theft, and also to distinguish between ‘natural’ and ‘unnatural’ sexual acts. Anscombe’s views, I argue, are closer to those of Thomas Aquinas and provide reasons for making the distinctions McCabe does not. An argument concerning the nature of the institution of marriage and the effects of non-marital acts on that institution is proposed as a way of strengthening Anscombe’s argument that contraception violates an exceptionless moral norm.In the 1960s, before the promulgation of Humanae Vitae, the Catholic philosophers Elizabeth Anscombe and Herbert McCabe OP debated whether there are convincing natural law arguments for the claim that contraception violates an exceptionless moral norm. This article revisits those arguments and critiques McCabe’s approach to natural law, concerned primarily with ‘social sin’ and not simply violations of ‘right reason,’ as one particularly ill-suited to addressing questions in sexual ethics and unable both to distinguish properly between certain forms of sexual wrongdoing and more obviously social sins such as theft, and also to distinguish between ‘natural’ and ‘unnatural’ sexual acts. Anscombe’s views, I argue, are closer to those of Thomas Aquinas and provide reasons for making the distinctions McCabe does not. An argument concerning the nature of the institution of marriage and the effects of non-marital acts on that institution is proposed as a way of strengthening Anscombe’s argument that contraception violates an exceptionless moral norm

The UK Approach to Insuring Defined Benefit Pension Plans

The United Kingdom established the Pension Protection Fund (PPF) in 2005 to guarantee defined benefit pensions. We model the PPF and show that it is likely to face many years of low claims interspersed irregularly with periods of very large claims. There is a significant chance that these claims will be so large that the PPF will default on its liabilities, leaving the Government with no option but to bail it out. The cause of this problem is the double impact of a fall in equity prices on the PPF: it makes sponsor firms more likely to default, and it makes defaulted plans more likely to be underfunded. We use our model to derive a fair premium for PPF insurance under different circumstances, to estimate the extent of cross-subsidies in the PPF between strong and weak sponsors and to show that risk rated premiums are unlikely to have a substantial effect on either the size or the lumpiness of claims unless they are so powerful that they force weaker sponsors to cut fund deficits and improve the match between assets and liabilities

Organizing the U.S. Health Care Delivery System for High Performance

Analyzes the fragmentation of the healthcare delivery system and makes policy recommendations -- including payment reform, regulatory changes, and infrastructure -- for creating mechanisms to coordinate care across providers and settings