Lyl-1 regulates primitive macrophages and microglia development

During ontogeny, macrophage populations emerge in the Yolk Sac (YS) via two distinct progenitor waves, prior to hematopoietic stem cell development. Macrophage progenitors from the primitive/ early EMP and transient-definitive/ late EMP waves both contribute to various resident primitive macrophage populations in the developing embryonic organs. Identifying factors that modulates early stages of macrophage progenitor development may lead to a better understanding of defective function of specific resident macrophage subsets. Here we show that YS primitive macrophage progenitors express Lyl-1, a bHLH transcription factor related to SCL/Tal-1. Transcriptomic analysis of YS macrophage progenitors indicate that primitive macrophage progenitors present at embryonic day 9 are clearly distinct from those present at later stages. Disruption of Lyl-1 basic helix-loop-helix domain leads initially to an increased emergence of primitive macrophage progenitors, and later to their defective differentiation. These defects are associated with a disrupted expression of gene sets related to embryonic patterning and neurodevelopment. Lyl-1-deficiency also induce a reduced production of mature macrophages/microglia in the early brain, as well as a transient reduction of the microglia pool at midgestation and in the newborn. We thus identify Lyl-1 as a critical regulator of primitive macrophages and microglia development, which disruption may impair resident-macrophage function during organogenesis

The epigenetic regulator RINF (CXXC5) maintains SMAD7 expression in human immature erythroid cells and sustains red blood cells expansion

The gene CXXC5, encoding a Retinoid-Inducible Nuclear Factor (RINF), is located within a region at 5q31.2 commonly deleted in myelodysplastic syndrome (MDS) and adult acute myeloid leukemia (AML). RINF may act as an epigenetic regulator and has been proposed as a tumor suppressor in hematopoietic malignancies. However, functional studies in normal hematopoiesis are lacking, and its mechanism of action is unknow. Here, we evaluated the consequences of RINF silencing on cytokineinduced erythroid differentiation of human primary CD34+ progenitors. We found that RINF is expressed in immature erythroid cells and that RINF-knockdown accelerated erythropoietin-driven maturation, leading to a significant reduction (~45%) in the number of red blood cells (RBCs), without affecting cell viability. The phenotype induced by RINF-silencing was TGFβ-dependent and mediated by SMAD7, a TGFβ- signaling inhibitor. RINF upregulates SMAD7 expression by direct binding to its promoter and we found a close correlation between RINF and SMAD7 mRNA levels both in CD34+ cells isolated from bone marrow of healthy donors and MDS patients with del(5q). Importantly, RINF knockdown attenuated SMAD7 expression in primary cells and ectopic SMAD7 expression was sufficient to prevent the RINF knockdowndependent erythroid phenotype. Finally, RINF silencing affects 5’-hydroxymethylation of human erythroblasts, in agreement with its recently described role as a Tet2- anchoring platform in mouse. Altogether, our data bring insight into how the epigenetic factor RINF, as a transcriptional regulator of SMAD7, may fine-tune cell sensitivity to TGFβ superfamily cytokines and thus play an important role in both normal and pathological erythropoiesis

Caractérisation fonctionnelle du facteur CXXC5 (RINF) au cours de l’hématopoïèse normale et pathologique

No abstractLes érythrocytes (globules rouges, GR) transportent le dioxygène (via l’hémoglobine) des poumons aux tissus de l’organisme. Leur production est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (CSH), garantes des cellules constituants le sang. Chez l’adulte, l’érythropoïèse (processus qui aboutit à la production d’érythrocytes) a lieu en continu dans la moelle osseuse pour produire au quotidien environ 1011 érythrocytes. C’est de loin le plus haut rendement de production cellulaire du corps humain. Ce processus est finement régulé par une balance prolifération versus différenciation et peut s’adapter aux besoins de l’organisme. Cependant, le moindre défaut de régulation peut aboutir progressivement à des désordres érythroïdes (anémies, polyglobulies, voire à des transformations leucémiques). Le gène CXXC5 (alias RINF, Retinoid-Inducible Nuclear Factor), a été découvert en 2009 comme une cible directe des rétinoïdes nécessaire à la granulopoïèse. En effet, des expériences d’invalidation par ARN interférence ont démontré que l’expression de ce facteur était essentielle à la différenciation granulocytaire terminale des cellules hématopoïétiques aussi bien normales (progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ cultivés en présence de G-CSF) que leucémiques (lignée NB4 traitée par l’ATRA, Acide Rétinoïque tout-trans). Ce gène est localisé en 5q31, une région fréquemment sujette à des délétions chromosomiques dans des hémopathies malignes. Il code un facteur chromatinien possédant un motif à doigt de Zinc de type CXXC, retrouvé conservé avec plusieurs modulateurs épigénétiques importants. Toutefois, la contribution fonctionnelle de RINF sur la maturation ou l’engagement des progéniteurs vers d’autres lignages hématopoïétiques, n’avait pas été déterminée. Mes travaux de thèse ont démontré l’implication de RINF dans l’érythropoïèse humaine par l’intermédiaire d’expériences de pertes et gains de fonction dans des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (de sang de cordon ombilical ou de moelle osseuse) cultivés en présence d’EPO. Nous avons identifié le mécanisme d’action moléculaire et démontré que SMAD7 (un gène codant un inhibiteur de la voie de signalisation du TGF-β) était une cible transcriptionnelle directe de RINF (mis en évidence par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette cible a été validée sur des cellules primaires et dans deux lignées érythroleucémiques K562 et UT7). Nous avons également montré que ce mécanisme d’action est dépendant du TGF-β (par l’utilisation d’un inhibiteur du TGF-βRI sur des cellules primaires en culture). Ainsi, la perte d’expression du gène RINF/CXXC5 au cours de l’érythropoïèse sensibilise les érythroblastes au TGF-β et conduit à une production d’érythrocytes plus restreinte (et contribuerait ainsi in vivo à la cytopénie du lignage érythroïde). Enfin, la caractérisation phénotypique du modèle murin génétiquement invalidé pour le gène Rinf a été initiée. Mes travaux ont notamment mis en évidence une perte importante de viabilité et de fertilité des souris Rinf-/-. L’hématopoïèse murine a aussi été explorée. Les résultats préliminaires nous laissent penser que la régulation de Smad7 par le facteur RINF (mise en évidence dans l’érythropoïèse humaine) s’exerce aussi dans le tissu hématopoïétique murin. Ce facteur épigénétique pourrait jouer un rôle important en modulant (1) les capacités d’expansion et d’auto-renouvellement des progéniteurs hématopoïétiques, (2) leur sensibilité au TGF-β (via Smad7) et/ou (3) les processus d’hydroxyméthylation de l’ADN génomique

Functional characterization of factor CXXC5 (RINF) in normal and pathological hematopoiesis

Les érythrocytes (globules rouges, GR) transportent le dioxygène (via l’hémoglobine) des poumons aux tissus de l’organisme. Leur production est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (CSH), garantes des cellules constituants le sang. Chez l’adulte, l’érythropoïèse (processus qui aboutit à la production d’érythrocytes) a lieu en continu dans la moelle osseuse pour produire au quotidien environ 1011 érythrocytes. C’est de loin le plus haut rendement de production cellulaire du corps humain. Ce processus est finement régulé par une balance prolifération versus différenciation et peut s’adapter aux besoins de l’organisme. Cependant, le moindre défaut de régulation peut aboutir progressivement à des désordres érythroïdes (anémies, polyglobulies, voire à des transformations leucémiques). Le gène CXXC5 (alias RINF, Retinoid-Inducible Nuclear Factor), a été découvert en 2009 comme une cible directe des rétinoïdes nécessaire à la granulopoïèse. En effet, des expériences d’invalidation par ARN interférence ont démontré que l’expression de ce facteur était essentielle à la différenciation granulocytaire terminale des cellules hématopoïétiques aussi bien normales (progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ cultivés en présence de G-CSF) que leucémiques (lignée NB4 traitée par l’ATRA, Acide Rétinoïque tout-trans). Ce gène est localisé en 5q31, une région fréquemment sujette à des délétions chromosomiques dans des hémopathies malignes. Il code un facteur chromatinien possédant un motif à doigt de Zinc de type CXXC, retrouvé conservé avec plusieurs modulateurs épigénétiques importants. Toutefois, la contribution fonctionnelle de RINF sur la maturation ou l’engagement des progéniteurs vers d’autres lignages hématopoïétiques, n’avait pas été déterminée. Mes travaux de thèse ont démontré l’implication de RINF dans l’érythropoïèse humaine par l’intermédiaire d’expériences de pertes et gains de fonction dans des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (de sang de cordon ombilical ou de moelle osseuse) cultivés en présence d’EPO. Nous avons identifié le mécanisme d’action moléculaire et démontré que SMAD7 (un gène codant un inhibiteur de la voie de signalisation du TGF-β) était une cible transcriptionnelle directe de RINF (mis en évidence par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette cible a été validée sur des cellules primaires et dans deux lignées érythroleucémiques K562 et UT7). Nous avons également montré que ce mécanisme d’action est dépendant du TGF-β (par l’utilisation d’un inhibiteur du TGF-βRI sur des cellules primaires en culture). Ainsi, la perte d’expression du gène RINF/CXXC5 au cours de l’érythropoïèse sensibilise les érythroblastes au TGF-β et conduit à une production d’érythrocytes plus restreinte (et contribuerait ainsi in vivo à la cytopénie du lignage érythroïde). Enfin, la caractérisation phénotypique du modèle murin génétiquement invalidé pour le gène Rinf a été initiée. Mes travaux ont notamment mis en évidence une perte importante de viabilité et de fertilité des souris Rinf-/-. L’hématopoïèse murine a aussi été explorée. Les résultats préliminaires nous laissent penser que la régulation de Smad7 par le facteur RINF (mise en évidence dans l’érythropoïèse humaine) s’exerce aussi dans le tissu hématopoïétique murin. Ce facteur épigénétique pourrait jouer un rôle important en modulant (1) les capacités d’expansion et d’auto-renouvellement des progéniteurs hématopoïétiques, (2) leur sensibilité au TGF-β (via Smad7) et/ou (3) les processus d’hydroxyméthylation de l’ADN génomique.No abstrac

Lyl-1 marks and regulates primitive macrophages and microglia development

During ontogeny, resident macrophages (MΦs) of the nervous system emerge from haematopoietic stem cell-independent progenitors originating in the Yolk Sac (YS), so that factors impairing YS MΦ development may lead to neurodevelopmental disorders resulting from defective brain resident MΦ.Here we show that Lyl-1, a bHLH transcription factor related to Scl/Tal-1, marks primitive macrophage (MΦ Prim ) progenitors in the YS. Transcriptomic analysis of YS MΦ progenitors indicated that MΦ Prim progenitors present at embryonic day (E) 9 are clearly distinct from those present at E10. Lyl-1 bHLH disruption led to an increased production and a defective differentiation of MΦ Prim progenitors. These differentiation defects were associated with profound modifications of the expression of genes involved in embryonic patterning and neurodevelopment. They also induced a reduced production of mature MΦ/microglia in the early brain, as well as a transient reduction of the microglia pool at midgestation and in the new-born.We thus identify Lyl-1 as a critical regulator of MΦ Prim and microglia development, which disruption may impair organogenesis, including neurodevelopment processes.Key points: 1-Lyl-1 expression marks yolk sac macrophages and brain macrophage/microglia/BAM. 2-Lyl-1 deficiency impairs primitive macrophage development and leads to the up-regulation of genes involved in embryo patterning. 3-Lyl-1-expressing primitive macrophages have an immuno-modulatory phenotype. 4-Lyl-1 deficiency impairs microglia development and the expression of genes involved in neuro-development

The epigenetic regulator RINF (CXXC5) maintains <I>SMAD7</I> expression in human immature erythroid cells and sustains red blood cell expansion

International audienceThe gene CXXC5, encoding a retinoid-inducible nuclear factor (RINF), is located within a region at 5q31.2 commonly deleted in myelodysplastic syndrome and adult acute myeloid leukemia. RINF may act as an epigenetic regulator and has been proposed as a tumor suppressor in hematopoietic malignancies. However, functional studies in normal hematopoiesis are lacking, and its mechanism of action is unknown. Here, we evaluated the consequences of RINF silencing on cytokine-induced erythroid differentiation of human primary CD34+ progenitors. We found that RINF is expressed in immature erythroid cells and that RINF-knockdown accelerated erythropoietin-driven maturation, leading to a significant reduction (~45%) in the number of red blood cells, without affecting cell viability. The phenotype induced by RINF-silencing was dependent on tumor growth factor b (TGFb) and mediated by SMAD7, a TGFb-signaling inhibitor. RINF upregulates SMAD7 expression by direct binding to its promoter and we found a close correlation between RINF and SMAD7 mRNA levels both in CD34+ cells isolated from bone marrow of healthy donors and myelodysplastic syndrome patients with del(5q). Importantly, RINF knockdown attenuated SMAD7 expression in primary cells and ectopic SMAD7 expression was sufficient to prevent the RINF knockdown-dependent erythroid phenotype. Finally, RINF silencing affects 5’-hydroxymethylation of human erythroblasts, in agreement with its recently described role as a TET2-anchoring platform in mouse. Collectively, our data bring insight into how the epigenetic factor RINF, as a transcriptional regulator of SMAD7, may fine-tune cell sensitivity to TGFb superfamily cytokines and thus play an important role in both normal and pathological erythropoiesis