Identification et caractérisation de nouveaux facteurs régulant la réponse aux protéines mal repliées

Cellular homeostasis is maintained by quality control pathways that counteract the deleterious effects of intra- or extra-cellular stresses. The unfolded protein response (UPR) is a conserved transcriptional signaling pathway that regulates the endoplasmic reticulum (ER) protein folding capacity by adapting it to cellular needs. When misfolded proteins accumulate in the ER lumen - a situation defined as ER stress - activation of the UPR induces the transcription of genes whose products counteract the harmful effects of stress. In the nucleus, the different steps of gene expression are also subjected to a rigorous quality control (QC) which ensures that only mature mRNAs are exported to the cytoplasm. In particular, the chromatin remodeling factor Isw1, as well as the nuclear exosome catalytic subunit Rrp6, cooperatively contribute to nuclear retention and /or degradation of immature RNAs. This QC of mRNA biogenesis and export relies on the ability of Isw1 to interact directly with RNAs as well as on the catalytic activity of Rrp6. The identification of the transcript encoding the central regulator of the UPR as a target of Isw1 and, conversely, the identification of ISW1 as a transcriptional target of the UPR, suggest the existence of reciprocal signaling between these two QC systems. The objective of this work was to characterize the reciprocal signaling between the UPR and the nuclear QC of mRNAs biogenesis mediated by Isw1 and Rrp6. A combination of genomic, genetic, biochemical and microscopic approaches allowed to establish, in the model yeast Saccharomyces cerevisiae, that Isw1 is a new player in UPR which, through its ability to interact with the mRNA encoding the transcription factor of UPR, contributes to its precise termination. While the mechanisms of UPR activation have been well-characterized, those that govern the termination of this signaling pathway are much less known. However, chronic UPR signaling causes cell death in both yeast and mammals. The novel role of Isw1 in the regulation of UPR termination highlighted during this work has crucial physiological consequences since it regulates the survival of cells subjected to ER stress. Similar approaches have established that Rrp6, via its exonuclease activity, also contributes to the regulation of UPR, by limiting its induction and duration. Altogether, this work allowed to highlight new mechanisms that regulate the intensity and duration of the UPR, two parameters known to play a key role in the survival of cells experiencing ER stress.L'homéostasie cellulaire est assurée par des systèmes de contrôle qualité qui s'opposent aux effets délétères de stress intra ou extracellulaires. La réponse aux protéines mal repliées (Unfolded Protein Response, UPR), une voie de signalisation transcriptionnelle conservée, régule la capacité de repliement des protéines du réticulum endoplasmique (RE) en l'adaptant aux besoins cellulaires. Ainsi, lorsque des protéines mal repliées s'accumulent dans la lumière du RE -une situation définie comme stress du RE- l'activation de l'UPR induit la transcription de gènes dont les produits contrecarrent les effets nocifs du stress. Dans le noyau, les différentes étapes de l'expression génique sont également soumises à un contrôle qualité (CQ) rigoureux qui s'assure que seuls les ARNm matures sont exportés vers le cytoplasme. En particulier, le facteur de remodelage de la chromatine Isw1, ainsi que la sous-unité catalytique de l'exosome nucléaire Rrp6, contribuent de manière coopérative à la rétention nucléaire et /ou à la dégradation des ARN immatures. Cette activité de contrôle qualité de la biogenèse et de l'export des ARNm repose sur la capacité de Isw1 à interagir directement avec les ARN ainsi que sur l'activité catalytique de Rrp6. L'identification du transcrit codant le régulateur central de l'UPR comme substrat de Isw1 et, réciproquement, l'identification de ISW1 comme cible transcriptionnelle de l'UPR, suggèrent l'existence de signalisations réciproques entre ces deux systèmes de contrôle qualité. L'objectif de ce travail était de mettre en évidence et de caractériser les signalisations réciproques entre l'UPR et le CQ nucléaire de la biogenèse des ARNm dépendant de Isw1 et Rrp6. Une combinaison d'approches génomiques, génétiques, biochimiques et microscopiques a permis d'établir, chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae, que Isw1 est un nouvel acteur de l'UPR qui, par sa capacité à interagir avec l'ARNm codant le facteur de transcription de l'UPR, contribue à sa terminaison précise. Alors que les mécanismes d'activation de l'UPR ont été amplement caractérisés, ceux qui gouvernent la fermeture de cette voie de signalisation sont beaucoup moins connus. Pourtant, une signalisation UPR chronique entraîne la mort cellulaire aussi bien chez la levure que chez les mammifères. Le nouveau rôle de Isw1 dans la régulation de la terminaison de l'UPR mis en évidence au cours de ces travaux a donc des conséquences physiologiques cruciales puisqu'elle régule la survie de cellules soumises au stress du RE. Des approches similaires ont permis d'établir que Rrp6, via son activité exonucléase, contribue également à la régulation de l'UPR, en limitant son induction et sa durée. L'ensemble de ces travaux a donc permis de révéler de nouveaux mécanismes de régulation de l'intensité et de la durée de l'UPR, deux paramètres connus pour jouer un rôle clé dans la survie de cellules soumises au stress du RE

Identification and characterization of new factors regulating the unfolded protein response

L'homéostasie cellulaire est assurée par des systèmes de contrôle qualité qui s'opposent aux effets délétères de stress intra ou extracellulaires. La réponse aux protéines mal repliées (Unfolded Protein Response, UPR), une voie de signalisation transcriptionnelle conservée, régule la capacité de repliement des protéines du réticulum endoplasmique (RE) en l'adaptant aux besoins cellulaires. Ainsi, lorsque des protéines mal repliées s'accumulent dans la lumière du RE -une situation définie comme stress du RE- l'activation de l'UPR induit la transcription de gènes dont les produits contrecarrent les effets nocifs du stress. Dans le noyau, les différentes étapes de l'expression génique sont également soumises à un contrôle qualité (CQ) rigoureux qui s'assure que seuls les ARNm matures sont exportés vers le cytoplasme. En particulier, le facteur de remodelage de la chromatine Isw1, ainsi que la sous-unité catalytique de l'exosome nucléaire Rrp6, contribuent de manière coopérative à la rétention nucléaire et /ou à la dégradation des ARN immatures. Cette activité de contrôle qualité de la biogenèse et de l'export des ARNm repose sur la capacité de Isw1 à interagir directement avec les ARN ainsi que sur l'activité catalytique de Rrp6. L'identification du transcrit codant le régulateur central de l'UPR comme substrat de Isw1 et, réciproquement, l'identification de ISW1 comme cible transcriptionnelle de l'UPR, suggèrent l'existence de signalisations réciproques entre ces deux systèmes de contrôle qualité. L'objectif de ce travail était de mettre en évidence et de caractériser les signalisations réciproques entre l'UPR et le CQ nucléaire de la biogenèse des ARNm dépendant de Isw1 et Rrp6. Une combinaison d'approches génomiques, génétiques, biochimiques et microscopiques a permis d'établir, chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae, que Isw1 est un nouvel acteur de l'UPR qui, par sa capacité à interagir avec l'ARNm codant le facteur de transcription de l'UPR, contribue à sa terminaison précise. Alors que les mécanismes d'activation de l'UPR ont été amplement caractérisés, ceux qui gouvernent la fermeture de cette voie de signalisation sont beaucoup moins connus. Pourtant, une signalisation UPR chronique entraîne la mort cellulaire aussi bien chez la levure que chez les mammifères. Le nouveau rôle de Isw1 dans la régulation de la terminaison de l'UPR mis en évidence au cours de ces travaux a donc des conséquences physiologiques cruciales puisqu'elle régule la survie de cellules soumises au stress du RE. Des approches similaires ont permis d'établir que Rrp6, via son activité exonucléase, contribue également à la régulation de l'UPR, en limitant son induction et sa durée. L'ensemble de ces travaux a donc permis de révéler de nouveaux mécanismes de régulation de l'intensité et de la durée de l'UPR, deux paramètres connus pour jouer un rôle clé dans la survie de cellules soumises au stress du RE.Cellular homeostasis is maintained by quality control pathways that counteract the deleterious effects of intra- or extra-cellular stresses. The unfolded protein response (UPR) is a conserved transcriptional signaling pathway that regulates the endoplasmic reticulum (ER) protein folding capacity by adapting it to cellular needs. When misfolded proteins accumulate in the ER lumen - a situation defined as ER stress - activation of the UPR induces the transcription of genes whose products counteract the harmful effects of stress. In the nucleus, the different steps of gene expression are also subjected to a rigorous quality control (QC) which ensures that only mature mRNAs are exported to the cytoplasm. In particular, the chromatin remodeling factor Isw1, as well as the nuclear exosome catalytic subunit Rrp6, cooperatively contribute to nuclear retention and /or degradation of immature RNAs. This QC of mRNA biogenesis and export relies on the ability of Isw1 to interact directly with RNAs as well as on the catalytic activity of Rrp6. The identification of the transcript encoding the central regulator of the UPR as a target of Isw1 and, conversely, the identification of ISW1 as a transcriptional target of the UPR, suggest the existence of reciprocal signaling between these two QC systems. The objective of this work was to characterize the reciprocal signaling between the UPR and the nuclear QC of mRNAs biogenesis mediated by Isw1 and Rrp6. A combination of genomic, genetic, biochemical and microscopic approaches allowed to establish, in the model yeast Saccharomyces cerevisiae, that Isw1 is a new player in UPR which, through its ability to interact with the mRNA encoding the transcription factor of UPR, contributes to its precise termination. While the mechanisms of UPR activation have been well-characterized, those that govern the termination of this signaling pathway are much less known. However, chronic UPR signaling causes cell death in both yeast and mammals. The novel role of Isw1 in the regulation of UPR termination highlighted during this work has crucial physiological consequences since it regulates the survival of cells subjected to ER stress. Similar approaches have established that Rrp6, via its exonuclease activity, also contributes to the regulation of UPR, by limiting its induction and duration. Altogether, this work allowed to highlight new mechanisms that regulate the intensity and duration of the UPR, two parameters known to play a key role in the survival of cells experiencing ER stress

Reproducibility of fluorescent expression from engineered biological constructs in E. coli

We present results of the first large-scale interlaboratory study carried out in synthetic biology, as part of the 2014 and 2015 International Genetically Engineered Machine (iGEM) competitions. Participants at 88 institutions around the world measured fluorescence from three engineered constitutive constructs in E. coli. Few participants were able to measure absolute fluorescence, so data was analyzed in terms of ratios. Precision was strongly related to fluorescent strength, ranging from 1.54-fold standard deviation for the ratio between strong promoters to 5.75-fold for the ratio between the strongest and weakest promoter, and while host strain did not affect expression ratios, choice of instrument did. This result shows that high quantitative precision and reproducibility of results is possible, while at the same time indicating areas needing improved laboratory practices.Peer reviewe