Étude de la toxicité causée par le gène C9orf72 dans la Sclérose Latérale Amyotrophique

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs. 10% des cas sont des cas familiaux et l’étude de ces familles a mené à la découverte de plusieurs gènes pouvant causer la SLA, incluant SOD1, TARDBP et FUS. L’expansion de la répétition GGGGCC dans le gène C9orf72 est, à ce jour, la cause la plus connue de SLA. L’impact de cette expansion est encore méconnu et il reste à déterminer si la toxicité est causée par un gain de fonction, une perte de fonction ou les deux. Plusieurs gènes impliqués dans la SLA sont conservés entre le nématode Caenorhabditis elegans et l’humain. C. elegans est un vers transparent fréquemment utilisé pour des études anatomiques, comportementales et génétiques. Il possède une lignée cellulaire invariable qui inclue 302 neurones. Aussi, les mécanismes de réponse au stress ainsi que les mécanismes de vieillissement sont très bien conservés entre ce nématode et l’humain. Donc, notre groupe, et plusieurs autres, ont utilisé C. elegans pour étudier plusieurs aspects de la SLA. Pour mieux comprendre la toxicité causée par l’expansion GGGGCC de C9orf72, nous avons développé deux modèles de vers pour étudier l’impact d’une perte de fonction ainsi que d’un gain de toxicité de l’ARN. Pour voir les conséquences d’une perte de fonction, nous avons étudié l’orthologue de C9orf72 dans C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Les vers mutants alfa-1(ok3062) développent des problèmes moteurs causant une paralysie et une dégénérescence spécifique des neurones moteurs GABAergiques. De plus, les mutants sont sensibles au stress osmotique qui provoque une dégénérescence. D’autre part, l’expression de la séquence d’ARN contenant une répétition pathogénique GGGGCC cause aussi des problèmes moteurs et de la dégénérescence affectant les neurones moteurs. Nos résultats suggèrent donc qu’un gain de toxicité de l’ARN ainsi qu’une perte de fonction de C9orf72 sont donc toxiques pour les neurones. Puisque le mouvement du vers peut être rapidement évalué en cultivant les vers dans un milieu liquide, nous avons développé un criblage de molécules pouvant affecter le mouvement des vers mutants alfa-1 en culture liquide. Plus de 4 000 composés ont été évalués et 80 ameliore la mobilité des vers alfa-1. Onze molécules ont aussi été testées dans les vers exprimant l’expansion GGGGCC et huit diminuent aussi le phénotype moteur de ces vers. Finalement, des huit molécules qui diminent la toxicité causée par la perte de fonction de C9orf72 et la toxicité de l’ARN, deux restaurent aussi l’expression anormale de plusieurs transcrits d’ARN observée dans des cellules dérivées de patient C9orf72. Avec ce projet, nous voulons identifier des molécules pouvant affecter tous les modes de toxicité de C9orf72 et possiblement ouvrir de nouvelles avenues thérapeutiquesAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder affecting the motor neurons. 10% of the cases are familial and using those families, many genes were shown to be involved in ALS pathogenesis, including SOD1, TARDBP and FUS. The GGGGCC repeat found in the first intron of C9orf72 is, to this day, the most common genetic cause of ALS. Many hypotheses have been speculated to explain the toxicity of the pathogenic GGGGCC repeat, including loss and gain of function mechanisms. Many proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are evolutionarily conserved in the worm Caenorhabditis elegans. C. elegans is a transparent nematode widely used for anatomical, behavioural and genetic studies. It possesses an invariant cell lineage that includes 302 neurons in the adult nematode. Also, cellular stress responses and survival mechanisms are genetically regulated and conserved from the nematode and human. Therefore, our group, and others, have used C. elegans to model different aspects of neurodegenerative diseases including ALS. To better understand the toxicity caused by the GGGGCC repeat expansion in C9orf72, we have developed two C. elegans models to understand either the impact of the loss of function of C9orf72 or the gain of toxicity of the RNA containing the GGGGCC repeat. To understand the loss of function, we have characterized the orthologue of C9orf72 in C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Mutant alfa-1 worms exhibit motor impairments leading to paralysis and neurodegenereation of the GABAergic neurons. Mutant worms are also sensitive to osmotic stress which can lead to increased neurodegeneration. On the other part, exposure of C. elegans neurons to the RNA containing the GGGGCC repeat causes also motor problem and degeneration affecting the motor neurons. Therefore, our data suggest that both loss of function of C9orf72 and toxic gain of function are detrimental to neurons. Since motor dysfunctions in worms can be easily accessed in liquid culture, we have screened more than 4,000 FDA approved compounds in the alfa-1(ok3062) worms. 80 molecules were shown to improve alfa-1 impaired function and eleven of those were also tested for their effect to reduce the neurotoxicity caused by the GGGGCC repeat RNA. Eight molecules were shown to affect both types of neurotoxicity. Finally, from these eight molecules that can improveboth types of toxicity, two were shown to restore the abnormal RNA expression observed in C9orf72 patient-derive cells. With this project, we aimed to identify molecules that can affect the loss of C9orf72 toxicity and the toxic gain of RNA function containing the GGGGCC repeat to hopefully open new therapeutic avenues for ALS patients

Caractérisation du décalage du cadre de lecture de la protéine ataxine-3

Les expansions du codon CAG (polyQ) sont impliquées dans neuf maladies neurodégénératives. Notre groupe a démontré que, lors de la traduction de la protéine ataxine-3 (Atx3) mutée qui est impliquée dans l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3), un changement du cadre de lecture vers un cadre décalé -1 (GCA) se produit. La traduction dans ce nouveau cadre de lecture entraine la production de polyalanine et ceci amplifierait la toxicité des polyQ. Le changement de cadre de lecture (ccl) ribosomique peut se produire des virus aux mammifères mais peu de choses sont connues sur son impact chez l’humain. Afin d’étudier ce phénomène dans la protéine Atx3 avec expansion de polyQ, nous avons établi un modèle de Drosophile transgénique et testé si c’était l’ARNm ou la protéine mutée qui était toxique. Nous avons aussi employé un essai de toeprinting (TP) afin d’identifier l’emplacement précis où les ribosomes changent de cadre de lecture sur l’ARNm. Nos résultats indiquent que la toxicité est due à la présence de polyalanines faisant suite au ccl et que l’ARNm en soi n’est pas la cause directe de la toxicité. De plus, nous avons observé que les ribosomes s’arrêtent au 48ième codon glutamine et que cet arrêt est spécifique aux polyQ. L’arrêt des ribosomes a d’ailleurs aussi été observé dans d’autres maladies avec expansions de polyQ. Puisque ces maladies ont des caractéristiques communes, un blocage de ce ccl pourrait atténuer les symptômes des patients SCA3 et d’autres maladies à expansions de polyQCoding CAG repeat disorders have been associated with nine neurodegenerative disorders. Our group has previously shown that during the translation of mutant ataxine-3 (Atx3), the protein involved in Spinocerebellar Ataxia type 3 (SCA3), a ribosomal frameshift occurs and leads to the reading of a GCA frame rather than a CAG frame. This new reading frame causes the production of polyalanine in the polyglutamine peptide which increases its toxicity. Ribosomal frameshifts are known to occur in all organisms but little is known about this phenomenon in human. To study ribosomal frameshift along the ATXN3 transcript, we generated a transgenic Drosophila model in which we looked at the toxicity of the mRNA. Also, we developed a toeprinting assay to precisely evaluate where the change of reading frame occurs along the mRNA. Our results suggest that the toxicity observed in our Drosophila model results from the production of polyalanine and not from the presence of the mRNA per se. Moreover, the change in reading frame seems to occur at the 48th CAG codon and this pausing of the ribosome also occurs in other polyQ tracts. Because CAG repeat disorders share many characteristics, an alteration of the frameshift could alleviate symptoms of SCA3 patients as well as of many other diseases with coding CAG repeats

Cell Type-Specific Transcriptomics Reveals that Mutant Huntingtin Leads to Mitochondrial RNA Release and Neuronal Innate Immune Activation

The mechanisms by which mutant huntingtin (mHTT) leads to neuronal cell death in Huntington’s disease (HD) are not fully understood. To gain new molecular insights, we used single nuclear RNA sequencing (snRNA-seq) and translating ribosome affinity purification (TRAP) to conduct transcriptomic analyses of caudate/putamen (striatal) cell type-specific gene expression changes in human HD and mouse models of HD. In striatal spiny projection neurons, the most vulnerable cell type in HD, we observe a release of mitochondrial RNA (mtRNA) (a potent mitochondrial-derived innate immunogen) and a concomitant upregulation of innate immune signaling in spiny projection neurons. Further, we observe that the released mtRNAs can directly bind to the innate immune sensor protein kinase R (PKR). We highlight the importance of studying cell type-specific gene expression dysregulation in HD pathogenesis and reveal that the activation of innate immune signaling in the most vulnerable HD neurons provides a novel framework to understand the basis of mHTT toxicity and raises new therapeutic opportunities

Resolving CNS mRNA Heterogeneity: Examining mRNA Alternative Polyadenylation at a Cell-Type-Specific Level

Alternative polyadenylation often regulates mRNA isoform usage. In this issue of Neuron, Hwang et al. (2017) describe a powerful new cell-type-specific methodology, cTag-PAPERCLIP, which can be used to study alternative polyadenylation in the CNS. Keywords: alternative polyadenylation; cell type specificity; cTag-PAPERCLI

Deletion of C9ORF72 Results in Motor Neuron Degeneration and Stress Sensitivity in <i>C. elegans</i>

<div><p>An expansion of the hexanucleotide GGGGCC repeat in the first intron of <i>C9ORF72</i> gene was recently linked to amyotrophic lateral sclerosis. It is not known if the mutation results in a gain of function, a loss of function or if, perhaps both mechanisms are linked to pathogenesis. We generated a genetic model of ALS to explore the biological consequences of a null mutation of the <i>Caenorhabditis elegans C9ORF72</i> orthologue, <i>F18A1.6</i>, also called <i>alfa-1</i>. <i>alfa-1</i> mutants displayed age-dependent motility defects leading to paralysis and the specific degeneration of GABAergic motor neurons. <i>alfa-1</i> mutants showed differential susceptibility to environmental stress where osmotic stress provoked neurodegeneration. Finally, we observed that the motor defects caused by loss of <i>alfa-1</i> were additive with the toxicity caused by mutant TDP-43 proteins, but not by the mutant FUS proteins. These data suggest that a loss of <i>alfa-1/C9ORF72</i> expression may contribute to motor neuron degeneration in a pathway associated with other known ALS genes.</p> </div

Genetic interactions between <i>alfa-1(ok3062)</i>, <i>TDP-43</i>, and FUS.

<div><p>(A) <i>TDP-43</i>^<i>A315T</i>; <i>alfa-1(ok3062)</i> worms had a higher rate of paralysis that either <i>TDP-43</i>^<i>A315T</i> or <i>alfa-1(ok3062)</i> worms alone (P<0.005).</p> <p>(B) <i>FUS</i>^S57∆ worms, <i>alfa-1(ok3062)</i> worms, and <i>FUS</i>^S57∆; <i>alfa-1(ok3062)</i> worms showed similar rates of paralysis.</p></div

<i>alfa-1(ok3062)</i> mutants are sensitive to osmotic stress.

<div><p>(A) In thermal stress resistance assays, <i>alfa-1(ok3062)</i> mutants were indistinguishable from wild type N2 worms, and <i>daf-2</i>(e1370) were not statistically different <i>alfa-1(ok3062)</i>;<i>daf-2</i>(e1370) mutants.</p> <p>(B) In oxidative stress resistance assays, <i>alfa-1(ok3062)</i> mutants were indistinguishable from wild type N2 worms, and <i>daf-2</i>(e1370) were not statistically different <i>alfa-1(ok3062)</i>;<i>daf-2</i>(e1370) mutants.</p> <p>(C) <i>alfa-1(ok3062)</i> mutants were more sensitive to osmotic stress than N2 worms (P<0.005), while <i>alfa-1(ok3062)</i>;<i>daf-2</i>(e1370) worms are slightly more sensitive when compared to <i>daf-2</i>(e1370) worms alone.</p> <p>(D) The difference in sensitivity between <i>alfa-1(ok3062)</i>;<i>daf-2</i>(e1370) and <i>daf-2</i>(e1370) increases at 500 mM NaCl (P<0.005). At 600 mM NaCl, the effect of NaCl is too drastic to see a difference.</p> <p>(E) During thermal stress, <i>alfa-1(ok3062)</i> worms are not more sensitive to neurodegeneration than the <i>unc-47p::GFP</i> worms.</p> <p>(F) When exposed to 400 mM NaCl, <i>alfa-1(ok3062)</i> worms had a higher rate of neurodegeneration than <i>unc-47p::GFP</i> worms (*P<0.05).</p></div