Aplicación de la citometría de flujo al estudio en tiempo real de las interacciones entre especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en el estrés oxidativo inducido por xenobióticos

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NOS) presentan un destacado interés para diversos contextos de la medicina experimental y clínica. Ambas especies desempeñan una doble función en los sistemas biológicos aerobios, ya que favorecen tanto procesos metabólicos como celulares, mientras que, dada su acción oxidante, han sido asociadas con numerosas enfermedades, así como con el proceso de envejecimiento. A pesar de la poderosa y compleja maquinaria antioxidante de los organismos superiores, cuando la capacidad de estos mecanismos protectores es superada por la intensidad o duración de los procesos oxidativos, se produce una situación denominada estrés oxidativo, que se define como una alteración en el equilibrio entre la producción de ROS y las defensas antioxidantes, produciendo daño oxidativo. El estudio experimental de la actividad y el estrés oxidativo es un aspecto complicado debido a la complejidad de los procesos bioquímicos implicados y por la limitada vida media de las diferentes ROS y RNS que participan en los mismos. La citometría de flujo (CMF) se utiliza con gran frecuencia para el estudio cuantitativo de la generación intracelular de ROS y RNS gracias a la disponibilidad de diversos tipos de sustratos fluorogénicos y fluorocromos. El uso de sondas fluorescentes parece un enfoque simple y fácil para la detección y cuantificación de la producción de ROS y RNS en sistemas celulares. Sin embargo, hay muchas limitaciones y artefactos en esta metodología. Es por ello, que el objetivo principal del presente estudio es evaluar los problemas de especificidad de las sondas fluorescentes y la participación de diferentes ROS en diversas condiciones de estrés oxidativo. Los estudios citómicos se han desarrollado sobre células eucariotas (líneas celulares Jurkat y N13) y células procariotas (cepas de Escherichia coli B deficientes en la defensa antioxidante) con diferentes sustratos fluorogénicos y combinaciones de estos. Para ello se emplean diversos xenobióticos generadores de ROS y RNS. Se desarrollan ensayos por CMF que permiten detectar e interpretar posibles interferencias entre sustratos fluorogénicos y de los sustratos fluorogénicos con el sistema biológico que pueden limitar la aplicabilidad de ensayos multiparamétricos de estrés. Además, para abordar fenómenos temporales relacionados con la generación de ROS y RNS, se emplea la CMF en tiempo real. Se presenta un estudio en el que ha sido posible diseñar y desarrollar en diferentes modelos experimentales, ensayos por CMF que permiten medir la generación de ROS y RNS con diferentes sustratos fluorogénicos en suspensiones celulares tratadas con diversos xenobióticos. Ello nos ha permitido evaluar de forma objetiva las ventajas y limitaciones de una serie de sondas fluorescentes de relevancia en estudios experimentales de estrés oxidativo o nitrosativo. Aunque existen discrepancias en los ensayos multiparamétricos se propone una serie de recomendaciones para el diseño de paneles por CMF de estrés oxidativo.Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (NOS) are of outstanding interest in various areas of experimental and clinical medicine. Both species have a dual role in aerobic biological systems, supporting both metabolic and cellular processes, while, given their oxidative action, they have been associated with numerous diseases, as well as with the ageing process. Despite the powerful and complex antioxidant machinery of higher organisms, when the capacity of these protective mechanisms is exceeded by the intensity or duration of oxidative processes, a condition known as oxidative stress occurs, which is defined as an alteration in the balance between ROS production and antioxidant defences, causing oxidative damage. The experimental study of oxidative stress and activity is complicated by the complexity of the biochemical processes involved and by the limited half-life of the different ROS and RNS that are involved. Flow cytometry is widely used for the quantitative study of intracellular generation of ROS and RNS due to the availability of various types of fluorogenic substrates and fluorochromes. The use of fluorescent probes is a simple and easy approach for the detection and quantification of ROS and RNS production in cellular systems. However, there are many limitations and artefacts in this methodology. Therefore, the main objective of the present study is to evaluate the specificity issues of fluorescent probes and the involvement of different ROS in various oxidative stress conditions. Cytomics studies have been performed on eukaryotic cells (Jurkat and N13 cell lines) and prokaryotic cells (Escherichia coli B strains deficient in antioxidant defence) with different fluorogenic substrates and combinations of these. Various ROS- and RNS-generating xenobiotics are used for this approach. Flow cytometry assays are developed to detect and interpret possible interferences between fluorogenic substrates and of the fluorogenic substrates with the biological system that may limit the applicability of multi-parametric stress assays. In addition, real-time flow cytometry is used to investigate temporal phenomena related to the generation of ROS and RNS. We present a study in which it has been possible to design and develop, in different experimental models, flow cytometry assays to measure the generation of ROS and RNS with different fluorogenic substrates in cell suspensions treated with different xenobiotics. This has allowed us to objectively assess the advantages and limitations of several fluorescent probes of relevance in experimental studies of oxidative or nitrosative stress. Although discrepancies exist in multi-parametric assays, a guideline for the design of flow cytometry panels for oxidative stress is proposed

Conservación frigorífica de agrios

Los frutos cítricos, como órganos vivos, continúan respirando tras la recolección y en su evolución fisiológica van perdiendo peso, disminuyendo ligeramente la acidez, aumentado el índice Brix, disminuyendo el contenido en vitamina C, alterándose el sabor y aroma, etcétera, llegando a un envejecimiento y pérdida de calidad. Las reacciones químicas complejas que llevan a esta pérdida de calidad se producen tanto más lentamente cuanto más baja es la temperatura. Al mismo tiempo, los frutos recolectados son susceptibles de podredumbres por ataques de hongos, viéndose el crecimiento de éstos frenado también por las bajas temperaturas. De ahí que, la aplicación del frío a los frutos recolectados permita alargar su período de comercialización en fresco con las consiguientes ventajas económicas. También se utiliza el frío para almacenar frutos en períodos de riesgo de heladas en árbol, así como para dilatar el abastecimiento a las fábricas de derivados. Si la producción actual de agrios en España está alrededor de 2.700.000 tm con un 59 por 100 de exportación, un 11 por 100 de industrialización y un 30 por 100 de consumo interior, más mermas, se estima que el tratamiento frigorífico afecta a menos del 15 por 100 de la producción, siendo probable que aumente en el futuro este porcentaje debido a la mayor demanda de variedades tardías en la época estival. Desde luego es deseable una mayor utilización del frío para contribuir a un descenso del importante capítulo de mermas

Adequacy of degreening treatment to minimize physiological disorders during marketing of mandarins

[SPA] e índice de madurez antes que la coloración comercial de la piel, por lo que, en buena parte, son sometidas a tratamiento de desverdización. En la actualidad se utiliza el sistema de flujo continuo intermitente con 2-5 ppm de etileno, humedad relativa superior al 90%, temperatura de 20-22ºC, concentración de CO2 menor del 0,2% y de O2 superior al 20%. Siendo éstas las condiciones óptimas del tratamiento de desverdización con etileno, es inevitable que si la duración del mismo se prolonga excesivamente puedan aparecer alteraciones fisiológicas relacionadas con la senescencia durante la posterior comercialización, especialmente el ennegrecimiento y caída de cálices. En este trabajo se analiza la respuesta de cambio de color y la sensibilidad a las alteraciones fisiológicas de las variedades de mayor interés comercial, incluidas las nuevas mutaciones extratempranas de clementina Oronules de atractivo color naranja-rojizo intenso (Basol, Prenules, Clemenrubi, Cultifort y Orogros). La desverdización en las mismas condiciones ambientales antes señaladas, pero sin adición de etileno exógeno, resulta en una disminución de la velocidad de cambio de color pero también en una menor incidencia de alteraciones fisiológicas. Teniendo en cuenta estos factores hemos establecido tratamientos generales de desverdización en función del índice de color inicial y el destino final a la U.E. o a países de ultramar, procurando siempre minimizar las alteraciones fisiológicas al final de la comercialización. Cuando el índice de color (IC=1000.a/L.b) en la recolección es superior a –5, los frutos pueden ser desverdizados sin etileno, llegando a destino con adecuado color comercial. También se exponen en este trabajo los resultados positivos obtenidos con la aplicación postcosecha, previa a la desverdización con etileno, de diversas auxinas de síntesis. La aplicación de formulaciones del ácido 2,4 diclorofenoxiacético y del 3,5,6 tricloro-2 piridil-oxiacético, en inmersión a concentraciones de 10 ppm logró, en algunas variedades, una significativa reducción de la caída y ennegrecimiento del cáliz sin afectar negativamente al cambio de color ni a otros parámetros y atributos de calidad evaluados. [ENG] Most of early-season varieties of mandarins reach the minimum required maturity index and juice content before full external coloration. Therefore degreening is a common postharvest treatment applied to accelerate color change process. Continuous flow-trough system with ethylene concentration 2-5 ppm, 90% RH, temperature 20-22ºC, CO2 less than 0,2% and O2 over 20%, is widely used. Excessive degreening time results in physiological disorders related to senescence specially darkening and drop of calyx. In this paper, color changes and physiological disorders sensitivity are studied in cultivars of great commercial interest. The early Oronules mutations (Basol, Prenules, Clemenrubí, Cultifort and Orogros) of attractive orange-reddish color are also included in these studies. Fruit stored in the same conditions of continuous flow but without addition of ethylene also undergo a slower color evolution, nevertheless with little risk of physiological disorders. Taking into account all these factors, degreening treatments related to initial color and destination were established. Fruit with citrus color index (CCI=1000a/Lb) at harvest over -5, could be degreened without ethylene arriving at UE or overseas destinations with adequate commercial color. In this work are also exposed the effect of the postharvest auxins applications on the calyx disorders associated to degreening. In some cultivars, dipping 10 ppm of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid or 3,5,6-trichloro-2-pyridyloxyacetic acid reduced significantly darkening and drop of calyx without affect neither the color nor the quality parameters

Adecuación del tratamiento de desverdización para minimizar alteraciones fisiológicas durante la comercialización de mandarinas

Las mandarinas tempranas alcanzan los valores mínimos exigidos de porcentaje de zumo e índice de madurez antes que la coloración comercial de la piel, por lo que, en buena parte, son sometidas a tratamiento de desverdización. En la actualidad se utiliza el sistema de flujo continuo intermitente con 2-5 ppm de etileno, humedad relativa superior al 90%, temperatura de 20-22ºC, concentración de CO2 menor del 0,2% y de O2 superior al 20%. Siendo éstas las condiciones óptimas del tratamiento de desverdización con etileno, es inevitable que si la duración del mismo se prolonga excesivamente puedan aparecer alteraciones fisiológicas relacionadas con la senescencia durante la posterior comercialización, especialmente el ennegrecimiento y caída de cálices. En este trabajo se analiza la respuesta de cambio de color y la sensibilidad a las alteraciones fisiológicas de las variedades de mayor interés comercial, incluidas las nuevas mutaciones extratempranas de clementina Oronules de atractivo color naranja-rojizo intenso (Basol, Prenules, Clemenrubi, Cultifort y Orogros). La desverdización en las mismas condiciones ambientales antes señaladas, pero sin adición de etileno exógeno, resulta en una disminución de la velocidad de cambio de color pero también en una menor incidencia de alteraciones fisiológicas. Teniendo en cuenta estos factores hemos establecido tratamientos generales de desverdización en función del índice de color inicial y el destino final a la U.E. o a países de ultramar, procurando siempre minimizar las alteraciones fisiológicas al final de la comercialización. Cuando el índice de color (IC=1000.a/L.b) en la recolección es superior a –5, los frutos pueden ser desverdizados sin etileno, llegando a destino con adecuado color comercial. También se exponen en este trabajo los resultados positivos obtenidos con la aplicación postcosecha, previa a la desverdización con etileno, de diversas auxinas de síntesis. La aplicación de formulaciones del ácido 2,4 diclorofenoxiacético y del 3,5,6 tricloro-2 piridil-oxiacético, en inmersión a concentraciones de 10 ppm logró, en algunas variedades, una significativa reducción de la caída y ennegrecimiento del cáliz sin afectar negativamente al cambio de color ni a otros parámetros y atributos de calidad evaluados

Evolución de las características físico-químicas durante el desarrollo del melocotón cv. Queen Crest. Respuesta a los tratamientos con etileno.

En este trabajo se han evaluado diversos parámetros físico-químicos a lo largo del desarrollo de melocotones cv. "Queen Crest". Se observó una disminución paulatina en el contenido en clorofila, mientras que sólidos solubles y textura apenas han manifestado cambios significativos. En la fase de maduración, los parámetros que han reflejado unos cambios más notables han sido, contenido en antocianos, color y acidez. Los tratamientos con etileno (50 ppm) aceleran cambios en textura, color y sabor, lo que sugiere que su aplicación en frutos recogidos con anticipación, podría adelantar la presencia de estos en el mercado aún con tamaño inferior al de los que permanecen más tiempo en árbol

Conservación frigorífica de pomelos "marsh seedless" y "redblush"

Pomelos "Marsh Seedless" y "Redblush", recolectados en Diciembre, con vistas a evitar riesgos de heladas, se han almacenado a 10, 5 y 2ºC. Las temperaturas de 5 y 2ºC han producido lesiones por frío, fundamentalmente picado, mostrándose más resistente el Redblush. El calentamiento intermitente (18 horas a 20ºC/semana) y la conservación en régimen variable de temperaturas (1 semana a 10ºC por cada 3 semanas a 5ºC), se han mostrado eficaces en la reducción de los daños por frío. En este sentido ha logrado, también, efectos positivos, la utilización de cera al agua con 6% de polietileno y 4% de colofonia. En este trabajo se estudian además, las variaciones del peso, textura, color y acidez de los frutos, en las distintas condiciones de almacenamiento

Influencia de la temperatura de conservación en la eficacia del tratamiento de desastringencia de caqui

Debido al carácter astringente del caqui ‘rojo brillante’, la aplicación del tratamiento con altas concentraciones de CO2 tras la recolección, previamente a su almacenamiento, ha sido adoptado por la industria como método de eliminación de la astringencia manteniendo elevada firmeza del fruto. Sin embargo, en ciertos momentos de la campaña podría resultar interesante la aplicación de este tratamiento tras el periodo de almacenamiento. En el presente trabajo se ha estudiado la efectividad del tratamiento de desastringencia (98% CO2, 20ºC, 24h) aplicado tras diferentes periodos de conservación de la fruta a 15ºC, a 1ºC, así como a fruta previamente tratada con 1μl*1-1 de 1-MCP y conservada a 1ºC. El análisis de los parámetros relacionados con la pérdida de astringencia: taninos solubles, producción de acetaldehído y análisis sensorial, cuando el tratamiento fue aplicado tras la conservación de la fruta a 1ºC, con o sin aplicación de 1-MCP, indicaron que este mantuvo su eficacia durante los 40 días que duró el ensayo. Cuando el tratamiento de desastringencia fue aplicado tras la conservación a 15ºC, el menor descenso de los taninos solubles tras la aplicación del tratamiento a medida que avanzó la conservación, así como un menor incremento del contenido de acetaldehído indicaron una pérdida de efectividad del tratamiento cuando este fue aplicado tras 20 días de conservación a esta temperatura, lo que se corroboró con el análisis sensorial

Influence of storage temperature on effectiveness of astringency removal treatment of persimmon

[SPA] Debido al carácter astringente del caqui ‘rojo brillante’, la aplicación del tratamiento con altas concentraciones de CO2 tras la recolección, previamente a su almacenamiento, ha sido adoptado por la industria como método de eliminación de la astringencia manteniendo elevada firmeza del fruto. Sin embargo, en ciertos momentos de la campaña podría resultar interesante la aplicación de este tratamiento tras el periodo de almacenamiento. En el presente trabajo se ha estudiado la efectividad del tratamiento de desastringencia (98% CO2, 20ºC, 24h) aplicado tras diferentes periodos de conservación de la fruta a 15ºC, a 1ºC, así como a fruta previamente tratada con 1μl*l-1 de 1-MCP y conservada a 1ºC. El análisis de los parámetros relacionados con la pérdida de astringencia: taninos solubles, producción de acetaldehído y análisis sensorial, cuando el tratamiento fue aplicado tras la conservación de la fruta a 1ºC, con o sin aplicación de 1-MCP, indicaron que este mantuvo su eficacia durante los 40 días que duró el ensayo. Cuando el tratamiento de desastringencia fue aplicado tras la conservación a 15ºC, el menor descenso de los taninos solubles tras la aplicación del tratamiento a medida que avanzó la conservación, así como un menor incremento del contenido de acetaldehído indicaron una pérdida de efectividad del tratamiento cuando este fue aplicado tras 20 días de conservación a esta temperatura, lo que se corroboró con el análisis sensorial. [ENG] Because of the astringent character of persimmon ‘rojo brillante’, application of high concentrations of CO2 treatment after harvest, previosly to storage, has been adopted by industry as astringency removal method keeping high fruit firmness. However, at some moments of the harvest season the application of this treatment after storage period could be interesting. In the present work we have studied the efectiveness of the astringency removal treatment (98% CO2, 20ºC, 24 h) applied to fruit after different periods at 15ºC, at 1ºC, as well as to fruit treated with 1 μl*l-1 1-MCP previosly to be stored at 1ºC. Analysis of those parametres relationed with astringency loss: solubles tannins, acetaldehyde production and sensory evaluation, when the treatment was applied after fruit storage at 1ºC, with or without 1-MCP application, showed that the treatment maintained its efectiveness for 40 days experiment duration. When deastringency treatment was applied after 20 days storage at 15ºC a loss of efectiveness was observed. This fact is supported by the soluble taninns values, acetaldehyde content and sensory evaluation

Influencia de la temperatura de almacenamiento, encerado, preacondicionado y curado en la calidad del tangelo minneola

El tangelo Minneola (citrus paradisi Duncan x citrus reticulata Dancy), tiene buen tamaño y coloración naranja-rojiza. El objeto de este trabajo es el estudio de la efectividad de las bajas temperaturas (1º, 5º, 7º y 9º), encerado (5% polietileno + 5% resinas), preacondicionado (PA) a media temperatura y curado (Q) en la conservación dela calidad. La fruta fue almacenada dos años consecutivos durante 30 y 40 días más 7 días a 20%C simulando el periodo de almacenamiento y posterior comercialización. Se determinaron cambios en: peso, firmeza, color (IC), porcentaje de zumo, sólidos solubles (TSS), acidez (TA), atmósfera interna, volátiles en Zumo, sabor, comestibilidad y alteraciones fisiológicas. No se detectaron diferencias significativas en IC y porcentaje de zumo. TA disminuyó durante la conservación y la deformación ecuatorial incrementó correlacionándose con las pérdidas de humedad. Se observó un mayor porcentaje de etanol en frutos encerados. El menor contenido de este parámetro fue para los tratamientos de PA y Q. Respecto a las características organolépticas las puntuaciones iniciales fueron similares en ambas campañas. En 1999 estos valores se mantuvieron estables en comestibilidad y descendieron en sabor en mayor medida en los frutos encerados. En el 2000 el descenso se produjo en ambos parámetros llegándose a detectar malos sabores. En el año 99, el tangelo Minneola mostró susceptibilidad a los daños por frío (DF) incluso a 9"C. El encerado fue efectivo en la reducción de los mismos. En el 2000 no se observaron DF significativos en ninguno delos tratamientos. Parece que 5”C es la mejor temperatura de almacenamiento para conservar una calidad aceptable durante 40 días. La utilización de PA y Q para prevenir DF no afecta negativamente a los parámetros de calidad