Estudi de la implicació de la proteïna quinasa CK2 en via de senyalització de les auxines en arabidopsis thaliana

Aquesta tesi s’emmarca dins d’un projecte d’investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d’aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d’aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d’auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s’ha demostrat que la distribució asimètrica de l’auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l’auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d’auxina, com són la inhibició del creixement de l’arrel principal, l’absència d’arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s’ha comprovat que la percepció de l’auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l’auxina, però si en el transport d’aquesta hormona. Eliminant l’activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d’auxina i canvis en l’expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d’aquesta hormona cap a l’exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d’auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l’eliminació de l’activitat CK2 provoca l’acumulació d’aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d’aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d’estudi del segon capítol d’aquesta tesi. S’han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d’aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s’han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d’auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l’activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d’endocitosi diferent al d’aquests inhibidors. S’ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d’endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d’aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l’eliminació de la CK2 provoqués la formació d’endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer.This thesis is involved in a more general project that aims to characterise and study the protein kinase CK2 in vegetal systems. Protein kinase CK2 is a pleiotropic Ser/Thr kinase and evolutionary conserved in eukaryotes. Studies performed in different organisms, from yeast to humans, have highlighted the importance of CK2 in cell growth and cell-cycle control. However, the signalling pathways in which CK2 is involved have not been fully identified. The first chapter of this thesis involves for first time the protein kinase CK2 in the auxin signaling pathway. In plants, the phytohormone auxin is a major regulator of auxin cell growth. Recent discoveries have demonstrated that differential distribution of within plant tissues is essential for developmental processes, and that this distribution is dependent on polar auxin transport. We report here that a dominant-negative mutant of CK2 (CK2mut) in Arabidopsis thaliana shows phenotypic traits that are typically linked to alterations in auxin-dependent processes. However, CK2mut plants exhibit normal responses to exogenous indole-3-acetic acid (IAA) indicating that they are not affected in the perception of the hormone, but upstream in the pathway. We demonstrate that mutant plants are not deficient in IAA but are impaired in its transport. Using genetic and pharmacological tools we show that CK2 activity depletion hinders correct formation of auxin gradients and leads to widespread changes in the expression of auxin-related genes. In particular, members of the auxin efflux carrier family (PINs), and the protein kinase PINOID, both key regulators of auxin fluxes, were misexpressed. PIN4 and PIN7 were also found mislocalized, with accumulation in endosomal bodies. The endosomal bodies formation lead to think that CK2 has a role in vesicular traffic pathway of these carriers and this was the topic of the study of the second chapter of this thesis. We have used several inhibitors in order to identify the point of the pathway in which acts the CK2. We performed these experiments using both PIN7::PIN7-GFP and PIN1::PIN1-GFP as a model, because PIN1 is the carrier more characterized. The tyrphostin A23 treatment reveals that these endosomal vesicles formed by the CK2 inhibition are clathrin coated. The brefeldin A and wortmannin treatments have determined that CK2 acts in a different point of the pathway than these inhibitors. We have detected that the endosomal bodies obtained by CK2 inhibition are not stained by FM4-64 dye and are enlarged compared with the endosomes obtained by the BFA treatment. Finally, the cicloheximide treatment has allowed observing two effects. The first is that the formation of endosomes does not depend on de novo protein synthesis. The second one is that CK2 inhibition does not compromise the degradation of the PIN proteins in the vacuole. Therefore, our results seem to indicate that inhibition of CK2 entails the formation of aberrant sorting nexin endosomes, which may lead to think that this kinase would be involved in the retromer complex

Estudi de la implicació de la proteïna quinasa CK2 en la via de senyalització de les auxines en Arabidopsis thaliana

Aquesta tesi s'emmarca dins d'un projecte d'investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d'aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d'aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d'Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d'auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s'ha demostrat que la distribució asimètrica de l'auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l'auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d'Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d'auxina, com són la inhibició del creixement de l'arrel principal, l'absència d'arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s'ha comprovat que la percepció de l'auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l'auxina, però si en el transport d'aquesta hormona. Eliminant l'activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d'auxina i canvis en l'expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d'aquesta hormona cap a l'exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d'auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l'eliminació de l'activitat CK2 provoca l'acumulació d'aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d'aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d'estudi del segon capítol d'aquesta tesi. S'han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d'aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s'han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d'auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l'activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d'endocitosi diferent al d'aquests inhibidors. S'ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d'endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d'aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l'eliminació de la CK2 provoqués la formació d'endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer.This thesis is involved in a more general project that aims to characterise and study the protein kinase CK2 in vegetal systems. Protein kinase CK2 is a pleiotropic Ser/Thr kinase and evolutionary conserved in eukaryotes. Studies performed in different organisms, from yeast to humans, have highlighted the importance of CK2 in cell growth and cell-cycle control. However, the signalling pathways in which CK2 is involved have not been fully identified. The first chapter of this thesis involves for first time the protein kinase CK2 in the auxin signaling pathway. In plants, the phytohormone auxin is a major regulator of auxin cell growth. Recent discoveries have demonstrated that differential distribution of within plant tissues is essential for developmental processes, and that this distribution is dependent on polar auxin transport. We report here that a dominant-negative mutant of CK2 (CK2mut) in Arabidopsis thaliana shows phenotypic traits that are typically linked to alterations in auxin-dependent processes. However, CK2mut plants exhibit normal responses to exogenous indole-3-acetic acid (IAA) indicating that they are not affected in the perception of the hormone, but upstream in the pathway. We demonstrate that mutant plants are not deficient in IAA but are impaired in its transport. Using genetic and pharmacological tools we show that CK2 activity depletion hinders correct formation of auxin gradients and leads to widespread changes in the expression of auxin-related genes. In particular, members of the auxin efflux carrier family (PINs), and the protein kinase PINOID, both key regulators of auxin fluxes, were misexpressed. PIN4 and PIN7 were also found mislocalized, with accumulation in endosomal bodies. The endosomal bodies formation lead to think that CK2 has a role in vesicular traffic pathway of these carriers and this was the topic of the study of the second chapter of this thesis. We have used several inhibitors in order to identify the point of the pathway in which acts the CK2. We performed these experiments using both PIN7::PIN7-GFP and PIN1::PIN1-GFP as a model, because PIN1 is the carrier more characterized. The tyrphostin A23 treatment reveals that these endosomal vesicles formed by the CK2 inhibition are clathrin coated. The brefeldin A and wortmannin treatments have determined that CK2 acts in a different point of the pathway than these inhibitors. We have detected that the endosomal bodies obtained by CK2 inhibition are not stained by FM4-64 dye and are enlarged compared with the endosomes obtained by the BFA treatment. Finally, the cicloheximide treatment has allowed observing two effects. The first is that the formation of endosomes does not depend on de novo protein synthesis. The second one is that CK2 inhibition does not compromise the degradation of the PIN proteins in the vacuole. Therefore, our results seem to indicate that inhibition of CK2 entails the formation of aberrant sorting nexin endosomes, which may lead to think that this kinase would be involved in the retromer complex

The Arabidopsis SAC9 Enzyme defines a cortical population of early endosomes and restricts PI(4,5)P 2 to the Plasma Membrane

Membranes lipids, and especially phosphoinositides, are differentially enriched within the eukaryotic endomembrane system. This generates a landmark code by modulating the properties of each membrane. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P 2 ] specifically accumulates at the plasma membrane in yeast, animal and plant cells, where it regulates a wide range of cellular processes including endocytosis. However, the functional consequences of mispatterning PI(4,5)P 2 in plants are unknown. Here, we functionally characterized the phosphoinositide phosphatase SUPPRESSOR OF ACTIN9 ( SAC9 ) in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). We found that SAC9 depletion led to the ectopic localization of PI(4,5)P 2 on cortical intracellular compartments, which depends on PI4P and PI(4,5)P 2 production at the plasma membrane. SAC9 localizes to a subpopulation of trans -Golgi Network/early endosomes that are spatially restricted to a region close to the cell cortex and that are coated with clathrin. Furthermore, it interacts and colocalizes with the endocytic component Src Homology 3 Domain Protein 2 (SH3P2). In the absence of SAC9, SH3P2 localization is altered and the clathrin mediated endocytosis rate is significantly reduced. Thus, SAC9 is required to maintain efficient endocytic uptake, highlighting the importance of restricting the PI(4,5)P 2 pool at the plasma membrane for the proper regulation of endocytosis in plants. One-sentence summary SAC9 prevents the accumulation of PI(4,5)P 2 along the endocytic pathway in plants and thereby contributes to the clathrin mediated endocytosis process at the plasma membrane via its interaction with SH3P

Developmental control of plant Rho GTPase nano-organization by the lipid phosphatidylserine

International audienceRho GTPases are master regulators of cell signaling, but how they are regulated depending on the cellular context is unclear. Here, we show that the phospholipid phosphatidylserine acts as a 25 developmentally-controlled lipid rheostat that tunes Rho GTPase signaling in Arabidopsis. Live super-resolution single molecule imaging revealed that RHO-OF-PLANT6 (ROP6) is stabilized by phosphatidylserine into plasma membrane nanodomains, which is required for auxin signaling. Furthermore, we uncovered that the plasma membrane phosphatidylserine content varies during plant root development and that the level of phosphatidylserine modulates the quantity of ROP6 30 nanoclusters induced by auxin and hence downstream signaling, including regulation of endocytosis and gravitropism. Our work reveals that variations in phosphatidylserine levels are a physiological process that may be leveraged to regulate small GTPase signaling during development. One Sentence Summary: 35 Phosphatidylserine acts as a developmentally-controlled lipid rheostat that regulates auxin sensitivity and plant development