Etablissement et caractérisation de nouveaux modèles in vitro de barrière hémato-encéphalique (de la recherche fondamentale à la recherche appliquée)

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une composante cruciale de l unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l homéostasie cérébrale. En limitant l accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené lesscientifiques à développer différents modèles in vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture decellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de la BHE in vivo et s est avéré utile dans l étude des interactions cellulaires au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE (cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvée in vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont cultivés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d expression de pompes d efflux, démontrant qu ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l utilisation des modèles in vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles neprésentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments.The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillaries, is a crucial component of the neurogliovascular unit where it is responsible for brain homeostasis maintenance. By limiting the access of molecules to the brain parenchyma, it effectively protects the central nervous system (CNS) from harmful substances, but at the same time represents a major hurdle for potential neuropharmaceuticals to reach their central target. The difficulty to study BBB features and permeability in vivo led to the development of different in vitro BBB models. Our model, consisting of a coculture of brain capillary endothelial cells and glial cells, has been extensively characterized: it provides a robust model exhibiting in vivo BBB characteristics and hasproved useful in elucidating the cellular interactions at the level of the BBB in physiological and pathological conditions.The initially developed coculture model was completed by the addition of brain pericytes to design threecell culture models. Indeed, pericytes now appear as important actors of BBB formation and maintenance, but are often absent of in vitro BBB models. Gathering the three major cell populations forming the BBB endothelial cells, glial cells and pericytes seems important to more accurately reproduce in vivo configuration, with the aim of understanding cellular interactions in physiological and pathological conditions. On the basis of our original coculture model, two different three-cell culture models were designed: while pericytes were cultured distant from endothelial cells in the first model, both were closely associated in the second one. Both models were characterized in terms of endothelial marker expression and morphology, paracellular permeability and expression of efflux pumps, demonstrating that they provide reliable in vitro BBB models. They maybe useful in deciphering the contribution of pericytes to the BBB phenotype and in the response of BBB to injury, taking into account the gliovascular component. In most cases, the intended use of in vitro BBB models in drug discovery is to predict whether investigational drugs are likely to achieve relevant CNS exposure to elicit the desired pharmacological effect. However, in vitro BBB models usually do not allow high enough through put to efficiently evaluate the large number of compounds generated by pharmaceutical companies in early drug discovery stages.ARRAS-Bib.electronique (620419901) / SudocSudocFranceF

Astrocyte mediated modulation of blood-brain barrier permeability does not correlate with a loss of tight junction proteins from the cellular contacts

In the central nervous system (CNS) complex endothelial tight junctions (TJs) form a restrictive paracellular diffusion barrier, the blood-brain barrier (BBB). Pathogenic changes within the CNS are frequently accompanied by the loss of BBB properties, resulting in brain edema. In order to investigate whether BBB leakiness can be monitored by a loss of TJ proteins from cellular borders, we used an in vitro BBB model where brain endothelial cells in co-culture with astrocytes form a tight permeability barrier for 3H-inulin and 14C-sucrose. Removal of astrocytes from the co-culture resulted in an increased permeability to small tracers across the brain endothelial cell monolayer and an opening of the TJs to horseradish peroxidase as detected by electron microscopy. Strikingly, opening of the endothelial TJs was not accompanied by any visible change in the molecular composition of endothelial TJs as junctional localization of the TJ-associated proteins claudin-3, claudin-5, occludin, ZO-1 or ZO-2 or the adherens junction-associated proteins β-catenin or p120cas did not change. Thus, opening of BBB TJs is not readily accompanied by the complete loss of the junctional localization of TJ protein

Alteration of Blood–Brain Barrier Integrity by Retroviral Infection

The blood–brain barrier (BBB), which forms the interface between the blood and the cerebral parenchyma, has been shown to be disrupted during retroviral-associated neuromyelopathies. Human T Lymphotropic Virus (HTLV-1) Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP) is a slowly progressive neurodegenerative disease associated with BBB breakdown. The BBB is composed of three cell types: endothelial cells, pericytes and astrocytes. Although astrocytes have been shown to be infected by HTLV-1, until now, little was known about the susceptibility of BBB endothelial cells to HTLV-1 infection and the impact of such an infection on BBB function. We first demonstrated that human cerebral endothelial cells express the receptors for HTLV-1 (GLUT-1, Neuropilin-1 and heparan sulfate proteoglycans), both in vitro, in a human cerebral endothelial cell line, and ex vivo, on spinal cord autopsy sections from HAM/TSP and non-infected control cases. In situ hybridization revealed HTLV-1 transcripts associated with the vasculature in HAM/TSP. We were able to confirm that the endothelial cells could be productively infected in vitro by HTLV-1 and that blocking of either HSPGs, Neuropilin 1 or Glut1 inhibits this process. The expression of the tight-junction proteins within the HTLV-1 infected endothelial cells was altered. These cells were no longer able to form a functional barrier, since BBB permeability and lymphocyte passage through the monolayer of endothelial cells were increased. This work constitutes the first report of susceptibility of human cerebral endothelial cells to HTLV-1 infection, with implications for HTLV-1 passage through the BBB and subsequent deregulation of the central nervous system homeostasis. We propose that the susceptibility of cerebral endothelial cells to retroviral infection and subsequent BBB dysfunction is an important aspect of HAM/TSP pathogenesis and should be considered in the design of future therapeutics strategies

Barriere hemato-encephalique "in vitro"

INIST T 75013 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueSIGLEFRFranc

Étude des modifications cellulaires et moléculaires de la barrière hémato-encéphalique "in vitro" soumise à une ischémie

L'ischémie cérébrale s'accompagne de la formation d'un œdème qui est la conséquence d'une ouverture de la de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Nos travaux portent sur un modèle de BHE in vitro consistant en une coculture de cellules endothéliales et de cellules gliales. En ischémie, une augmentation précoce de perméabilité transcellulaire non spécifique est observée, ainsi que la présence d'une intercommunication entre les cellules gliales et les cellules endothéliales, responsable de l'ouverture de la BHE. L'un des facteurs impliqués en ischémie est le VEGF : l'ischémie régule sa transcription dans les cellules gliales ainsi que son récepteur Flt-1 par les cellules endothéliales. Flt-1 est polarisé au niveau de la membrane abluminale des cellules endothéliales et sa présence est limitée à une fenêtre de quelques heures après le début de l'ischémie. Ces résultats suggèrent la possibilité de plusieurs phases d'ouverture de la BHE.LENS-BU Sciences (624982102) / SudocSudocFranceF

Effets de l'acide lipoteichoïque des bactéries Gram-positives sur la barrière hémato-encéphalique in vitro

La barrière hémato-encéphalique (BHE) située au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) sépare le cerveau de la circulation systémique, jouant un rôle fondamental dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Le rôle important de la BHE tant en conditions physiologiques que pathologiques a conduit les chercheurs à mettre au point des modèles de BHE in vitro afin d étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des variations de la perméabilité de cette barrière. La réglementation en toxicologie et la politique actuelle de l Union Européenne, encourage fortement le développement et la validation de modèles in vitro. Le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives (ECVAM) a organisé en 2003 une réunion de travail sur les "méthodes in vitro de BHE et leur application en toxicologie" pour évaluer les modèles in vitro disponibles et discuter de leur application dans des stratégies de tests. Suite à cette réunion et en suivant le concept "réduire, améliorer, remplacer" qui tient lieu de ligne de conduite dans la mise au point des méthodes alternatives à l expérimentation animale, nous avons remplacé, dans le modèle habituellement utilisé au laboratoire, les cultures primaires de cellules gliales (GCs) nécessaires à la différenciation des cellules endothéliales cérébrales, par la lignée C6. Pour la première fois, l induction des caractéristiques structurales et fonctionnelles de la BHE a donc été comparée dans les BCECs placées en présence de GCs ou de C6. Les mesures de la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) montrent qu en présence de C6 les valeurs sont toujours inférieures à celles obtenues en présence de GCs. De plus la perméabilité endothéliale au saccharose et à l inuline est 2,5 fois plus élevée en présence de C6. Les études réalisées en immunofluorescence mettent en évidence une différenciation moins bonne des jonctions serrées en présence de C6. L expression et l activité de la P-gp sont fortement diminuées. La quantité de VEGF dosé dans les milieux de culture est 40 fois plus importante en présence de C6, ce qui pourrait expliquer la perméabilité élevée des BCECs co-cultivées avec les C6. Les résultats montrent donc que l utilisation des C6 à la place des GCs ne permet pas d obtenir un modèle fiable de BHE in vitro. Le modèle initial consistant en une co-culture de BCECs et de GCs a donc finalement été utilisé pour étudier l'effet de l'acide lipoteichoïque (LTA) et du muramyl dipeptide (MDP), composants de la paroi des bactéries Gram-positives, sur la structure et les fonctions de la BHE in vitro. L activation des GCs par le LTA perturbe l'intégrité de la BHE. Cet effet est renforcé par le MDP. L étude en immunofluorescence des protéines associées aux jonctions serrées montre une délocalisation d AHNAK indiquant un effet du LTA sur les jonctions serrées. L activation des GCs par le LTA a conduit à une sécrétion d oxyde nitrique (NO) ainsi que de TNF-a et d IL-1b, cytokines pro-inflammatoires. Ces composés contribueraient à la rupture de la BHE induite par le LTA. En effet le traitement direct des BCECs par le TNF-a ou l IL-1b ou un donneur de NO augmente la perméabilité de la BHE. De plus, le prétraitement par des anticorps dirigés contre les deux cytokines, des GCs activées par le LTA, bloque l'effet du LTA. La présence d un inhibiteur de la NO synthase inductible (le 1400W) limite l augmentation de la perméabilité induite par le LTA. Cette étude prouve pour la première fois que l activation des GCs par le LTA altère la BHE in vitro et montre que la NO synthase inductible et des cytokines pro-inflammatoires pourraient être les cibles thérapeutiques dans les pathologies du SNC induites par les bactéries Gram-positives.The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillary endothelial cells (BCECs), separates the cerebral compartment from the systemic circulation, playing a fundamental role in maintaining the homeostasis of the central nervous system (CNS). The important role that BBB plays both under physiological and pathological conditions lead scientist to look for in vitro models to study the cellular and molecular mechanisms responsible for the permeability variations of this barrier. In regulatory toxicology and in the context of the current European Union political scenario, the development and validation of in vitro models is of outmost importance. The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) organised in 2003 a workshop on BBB in vitro methods and their application in toxicology to discuss the in vitro models available and their application in integrated testing strategies. Taking into consideration the outcomes of this workshop and according to the 3Rs concept (reduction, refinement and replacement), we replaced in a well-established BBB in vitro model the primary glial cells (GCs) necessary for the differentiation of BCECs with the C6 glial cell line, to avoid the use of animals. For the first time, we compared directly the structural and functional differentiation of BCECs induced by C6 cells towards GCs. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) measurements showed that in the presence of C6 cells the values were always lower than in the presence of GCs. Permeability of the BCECs to both radioactive sucrose and FITC-inulin was 2.5-fold higher when cells were co-cultured with C6 than with GCs. Immunocytochemistry studies showed less developed tight junction pattern in the presence of C6. P-gp expression and activity were lower in BCECs co-cultured with C6 than with GCs. The levels of VEGF in the culture medium were 40-fold higher in the presence of C6, suggesting that VEGF was one of the factors responsible for impairing the endothelial barrier co-cultured with C6 cells. Therefore, C6 cell line failed to replace primary GCs in a reliable BBB in vitro model. Furthermore, we used the BBB model consisting of BBCECs co-cultured with primary GCs to investigate the effects of the Gram-positive bacterial cell wall components lipoteichoic acid (LTA) and muramyl dipeptide (MDP) on the structure and function of BBB in vitro. The activation of GCs with LTA disrupted BBB integrity and LTA effect was potentiated by MDP. Immunocytochemistry analysis for tight junction associated proteins showed a delocalisation of AHNAK, revealing that LTA altered the tight junction pattern. LTA-activated GCs produced nitric oxide (NO) and the pro-inflammatory cytokines TNF-a and IL-1b, which contributed to LTA-induced BBB disruption, since the direct treatment of the endothelial monolayer with TNF-a, IL-1b or a NO donor increased BBB permeability. In addition, the pre-treatment of LTA-activated GCs with antibodies against these two cytokines blocked LTA effect and the presence of 1400W, inhibitor of inducible NO synthase (iNOS), partially reversed LTA-induced decreased TEER. This study showed for the first time that LTA impaired the BBB in vitro through glia activation and suggested that free-radical scavengers and inhibitors of iNOS and of pro-inflammatory cytokines could be major targets for the adjunctive therapy of CNS pathologies induced by Gram-positive bacteria.LENS-BU Sciences (624982102) / SudocSudocFranceF

Modèles d'étude in vitro de la barrière hémato-encéphalique et leurs applications pharmacotoxicologiques

LENS-BU Sciences (624982102) / SudocSudocFranceF

Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes

International audienceIn contrast to the endothelial cells in large vessels where LDL receptors are downregulated, brain capillary endothelial cells in vivo express an LDL receptor. Using a cell culture model of the blood-brain barrier consisting of a coculture of brain capillary endothelial cells and astrocytes, we observed that the capacity of endothelial cells to bind LDL is enhanced threefold when cocultured with astrocytes. We next investigated the ability of astrocytes to modulate endothelial cell LDL receptor expression. We have shown that the lipid requirement of astrocytes increases the expression of endothelial cell LDL receptors. Experiments with dialysis membranes of different pore size showed that this effect is mediated by a soluble factor(s) with relative molecular mass somewhere between 3,500 and 14,000. Substituting astrocytes with smooth muscle cells or brain endothelium with endothelium from the aorta or the adrenal cortex did not enhance the luminal LDL receptor expression on endothelial cells, demonstrating the specificity of the interactions. This factor(s) is exclusively secreted by astrocytes cocultured with brain capillary endothelial cells, but it also upregulates the LDL receptor on other cell types. This study confirms the notion that the final fine tuning of cell differentiation is under local control

Drug transport to the brain: comparison between in vitro and in vivo models of the blood-brain barrier

International audienceThe aim of the present studies was to compare the transport of drugs using two in vitro models routinely used in our laboratories: a primary culture of brain microvessel endothelial cells and a coculture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. For this purpose we selected a set of compounds corresponding to a wide range of lipid solubility. Additionally the in vitro results were compared to in vivo results obtained with the single carotid injection, and a good correlation between in vivo extraction ratios (Et) and in vitro permeability coefficients (Pe) was shown as indicated by the Spearman's correlation coefficient (r = 0.90 and r = 0.96 for primary culture and coculture, respectively). The studies show that the use of brain capillary endothelial cells together with astrocytes is slightly more predictive and significantly easier than the use of primary cultured brain microvessels