Determination of taxonomic relationships among Brazilian taxa of Stylosanthes Sw., Leguminosae, using RAPD markers

A potencialidade dos RAPDs para estudos taxonômicos foi investigada em seis táxons de Stylosanthes Sw. Baseando-se na presença/ausência das bandas de RAPD, similaridades genéticas foram calculadas e um dendrograma construído de acordo com o método UPGMA. Dois grupos foram claramente diferenciados: um, representado por uma espécie anual (S. humilis), e outro, pelos táxons pertencentes ao complexo S. guianensis. Entre os táxons deste último grupo, os RAPDs foram capazes de discriminar S. gracilis, a qual estaria sob processo de divergência evolutiva.The potential use of RAPDs for taxonomic studies was investigated in six Stylosanthes Sw. taxa. Based on the presence/absence of RAPDs bands, genetic similarities were evaluated and a dendrogram was built according to the UPGMA procedure. Two groups were clearly differentiated, one represented by an annual species (S. humilis) and another by the controversial taxa belonging to the S. guianensis complex. Among taxa of the latter group RAPDs have proven useful for discriminating S. gracilis, that should be under a process of evolutionary divergence

Identificação molecular de Aspergillus spp. isolados de grãos de café

Algumas espécies pertencentes ao gênero Aspergillus possuem potencial para produção de Ocratoxina A (OA), uma micotoxina de efeitos nefrotóxicos, imunossupressivos, teratogênicos e carcinogênicos. Com o objetivo de identificar as espécies de Aspergillus que contaminam o interior de grãos de café, foram coletadas amostras em diferentes estádios de maturação do produto, em 16 propriedades produtoras do norte do estado do Paraná. Um total de 108 isolados de Aspergillus spp. foram identificados ao nível de espécie, pelo sequenciamento dos espaços internos transcritos (ITS1-5,8S-ITS2) do DNA ribossomal (rDNA). Os resultados revelaram a presença de espécies potencialmente ocratoxigênicas em 82% das regiões analisadas, sendo dentre estas, Aspergillus niger a espécie mais freqüentemente detectada,seguida por A. ochraceus, e A. carbonarius. É relatada pela primeira vez a presença de A. carbonarius em frutos de café coletados na árvore.Some species belonging to the genus Aspergillus are potential producers of ochratoxin A (OA), a mycotoxin with nephrotoxic, immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic effects. The aim of the present study was to identify the species of Aspergillus that contaminate the inside of coffee beans collected in the stage of maturation and drying, from 16 producing areas located in the northern region of the State of Paraná, in the South of Brazil. A total of 108 isolates of Aspergillus spp. was identified at the species level, by sequencing the internal transcribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) of ribosomal DNA (rDNA). The results revealed the presence of potentially ochratoxigenic species in 82% of the geographic regions studied, among which Aspergillus niger was the species most frequently detected, followed by A. ochraceus and A. carbonarius. The presence of A. carbonarius in immature coffee fruits harvested from trees is reported for the first time

Extension of the core map of common bean with EST-SSR, RGA, AFLP, and putative functional markers

Microsatellites and gene-derived markers are still underrepresented in the core molecular linkage map of common bean compared to other types of markers. In order to increase the density of the core map, a set of new markers were developed and mapped onto the RIL population derived from the ‘BAT93’ × ‘Jalo EEP558’ cross. The EST-SSR markers were first characterized using a set of 24 bean inbred lines. On average, the polymorphism information content was 0.40 and the mean number of alleles per locus was 2.7. In addition, AFLP and RGA markers based on the NBS-profiling method were developed and a subset of the mapped RGA was sequenced. With the integration of 282 new markers into the common bean core map, we were able to place markers with putative known function in some existing gaps including regions with QTL for resistance to anthracnose and rust. The distribution of the markers over 11 linkage groups is discussed and a newer version of the common bean core linkage map is proposed

Genetic and breeding of Candida sp for microbial rennet production

O coalho é uma mistura enzimática responsável pelo processo de coagulação do leite que é usado na fabricação de queijos. Ele é tradicionalmente isolado do quarto estômago de bezerros. O grande aumento no consumo mundial de queijos, associado ao alto custo do coalho animal, estimulou a busca de novas fontes de coalho. O presente trabalho teve como objetivo básico, desenvolver uma metodologia para o melhoramento genético de uma linhagem de Candida sp, uma levedura isolada do solo, a qual mostrou-se promissora para a produção de um substituto do coalho animal. As metodologias utilizadas para o melhoramento genético envolveram três ciclos de mutação-seleção, com o objetivo de aumentar a atividade coagulante e diminuir a atividade de outras proteases não específicas, que são responsáveis por causar sabor amargo ao queijo. A indução de variabilidade genética foi feita utilizando-se de irradiação ultravioleta em doses que permitiam 5% de sobrevivência. No primeiro ciclo de seleção, foram avaliadas 179 colônias (população C1); uma única colônia foi selecionada para dar origem, após mutagênese, à população C2, constituída de 70 colônias; este método foi repetido mais uma vez para dar origem ao terceiro ciclo seletivo. Ao final do terceiro ciclo de seleção, foi obtido um aumento de 98% para o caráter atividade coagulante e uma redução de 20% para o caráter atividade proteolítica. As metodologias utilizadas também permitiram estimar as variâncias genéticas e covariâncias ao nível das populações. Herdabilidade, progresso esperado com seleção e coeficiente de correlação genética entre atividade coagulante e atividade proteolítica foram igualmente estimados. Foi também objetivo deste trabalho, descrever o ciclo parassexual em Candida sp, uma vez que esta levedura não apresenta o ciclo sexual. Mutantes com duplas marcas auxotróficas foram obtidos após tratamento com a luz ultravioleta. Dois métodos foram utilizados para a seleção destes mutantes: o de enriquecimento com nistatina e o de isolamento total. O primeiro método mostrou rendimento cerca de quatro vezes maior em relação ao de isolamento total. As condições de obtenção e regeneração de protoplastos foram estabelecidas utilizando-se, inicialmente, a linhagem selvagem de Candida sp. Posteriormente, foi feita a fusão de protoplastos entre linhagens auxotróficas (pab bio e ura arg) com polietileno glicol. As colônias prototróficas formadas, foram selecionadas por complementação em meio mínimo. A partir de um produto de fusão nuclear selecionado, foram obtidos vários recombinantes monoauxotróficos, os quais apresentaram diâmetros nucleares semelhantes aos parentais. Este fato sugeriu que estes recombinantes auxotróficos se originaram por perdas cromossômicas. O ciclo parassexual descrito neste trabalho poderá ser útil, em futuros programas de melhoramento genético de Candida sp.Rennet is an enzymatic mixture responsible for the milk clotting process used in cheese manufacture. It is normally isolated from the fourth stomach of unweaned calves. The increasing world consumption of cheese and the high prices of calf rennet, stimulated the search for a suitable substitute for rennet The basic aim of this research was to develop a method for genetic improvement of a strain of Candida sp, a soil isolated yeast, which showed good potential as a rennet substitute. The methodologies used for genetic breeding involved three cycles of mutagenesis and selection. The objective was to select strains producing specific coagulating activity with only low levels of non-specific proteinases that are responsible for the bitter flavour of cheese. Genetic variability was induced by using ultra violet rays as a mutagenic agent. The treatment times were chosen to give 5% survival. 0n the first selection cycle, 179 colonies were evaluated (C1 population); to prepare cell populations for the second cycle of mutagenesis, one colony -was selected; in this and in the subsequent cycle of selection, 70 colonies were picked for assay. At the end of the third cycle, a near 98% increase in coagulating activity was achieved and a 20% decrease in proteolytic activity was obtained. The methodology used also allowed the estimation of genetic and phenotypic variances and covariances at the population level. Heritability, genetic progress through selection, coefficient of genetic correlation between clotting activity and proteolytic activity were also estimated. The objective of this work was also to describe the parasexual cycle of Candida sp, which is generally considered to exist in the asexual state. Double auxotrophic mutants were selected from U .V. mutagenized cultures. Two methods were used to recover them, such us, nystatin enrichment and total isolation. The enrichment method was shown to be f our times better than the total isolation method. The conditions for protoplast isolation and regeneration were established for the wild-type strain of Candida sp. Protoplasts prepared from the auxotrophic strains (pab bio and ura arg) were fused with polyethylene glycol. Prototrophic derivatives formed by this fusion protocol were selected by complementation on minimal medium. From a selected nuclear fusion product, several monoauxotrophic recombinants were obtained, whose nuclear diameter remained similar to the parental ones. This fact suggested that the auxotrophic recombinants arose from chromosome loss. The parasexual cycle described by this research may be useful in future for genetic improvement programmers of Candida sp

Genetic characterization and citologic data in Aspergillus niger van Tieghem and Aspergillus awamori Nakazawa

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar linhagens amilolíticas de A. awamori (ATCC 22342 e ATCC 11382) e de A. niger (ATCC 22343 e ATCC 10864) considerando a caracterização genética e aspectos citológicos. Na análise citológica dos conídios foi verificado que as linhagens ATCC 22342 e ATCC 22343 produzem conídios uni, bi, tri e tetranucleados e, as linhagens ATCC 10864 e ATCC 11382, conídios uni e binucleados. Entre as linhagens ocorreu variação nas frequências dos diferentes tipos de conídios formados. Nos diplóides isolados, houve redução nas frequências de conídios com mais de um núcleo em relação às linhagens que lhe originaram. Foi observado que as linhagens ATCC 22342 e ATCC 22343 estavam em condições heterocariótica, para prolina ou arginina; também foi identificado o local do bloqueio metabólico da síntese desses aminoácidos, através do crescimento das colônias em meios diferenciais. Das linhagens originalmente heterocarióticas, foi possível isolar colônias prototróficas, auxotróficas e colônias proto/auxotróficas para prolina ou arginina. As quatro linhagens foram avaliadas quanto à produção de enzimas amilolíticas através do índice do halo de degradação do amido. As linhagens apresentaram variação de produção, destacando-se a linhagem ATCC 22342 como a mais promissora. Os diplóides se mostraram superiores em relação aos mutantes que lhes originaram, principalmente o diplóide interespecífico. Os testes em meios contendo quantidades crescentes de glicose indicaram que, possivelmente, as enzimas não são reprimidas catabolicamente pela glicose. Em relação a análise eletroforética para esterases, ficou evidenciado que as linhagens apresentam diferenças quanto ao padrão de bandas, fato também comprovado para sensibilidade ao benlate. Mutantes auxotróficos e morfológicos foram obtidos pelo método de isolamento total, e em A. awamori pelo método de enriquecimento por filtração, conseguindo-se um aumento de 41 vezes em relação ao método anterior. Pelas técnicas clássicas foram obtidos diplóides entre mutantes da mesma linhagem e de espécies diferentes. A diploidia foi confirmada pelo crescimento idêntico em meio mínimo e meio completo (MC), pela produção de setores em MC e MC + pfa e, pelo número de núcleos presentes nos conídios. Na fusão de protoplastos de A. awamori e A. niger foi possível isolar produtos de fusão porém em baixa frequência.The present research was carried out with the aim of studing amylolytic strains of A. awamori (ATCC 22342 and ATCC 11382) and of A. niger (ATCC 22343 and ATCC 10864) considering the genetic characterization and cytological aspects. In cytological analysis of the conidia was verified that the ATCC 22342 and ATCC 22343 strains produced conidia with one, two, three and four nuclei, and the ATCC 10864 and ATCC 11382 strains produced conidia with one and two nuclei. Among the strains occurred variation in the frequencies of different types of conidia. It was observed that the ATCC 22342 and ATCC 22343 strains were in heterokaryotic condition, for proline or arginine, and it was also identified the site of metabolic blockade of the synthesis of these aminoacids through the growth of the colonies in differentiated media. It was possible to isolate prototrophic colonies, auxotrofic colonies for proline or arginina and, proto/auxotrofic colonies from the heterokaryotic strains. The four strains were evaluated for production of amylolytic enzymes through the halo index of the starch degradation. These strains presented variation in production; the ATCC 22342 standed out as the most promissing. The diploids, mainly the interespecific one, were superior to the original mutants. The trials in media containing crescent amounts of glucose indicated that, the enzymes, possibly, are not repressed by glucose. In relation to eletrophoretic analysis for esterases, it was showed that strains presented differences for the bands standard; this event was confirmed by the sensitivity to benlate. Auxotrofic and morfologic were obtained by the method of total isolation and, by the technique of filtration enrichment in A. awamori was obtained an increase of 41 times of auxotrophic mutants. By using classic techniques were obtained diploids among mutants of the same strain, and among strains of different species. The diploidy was confirmed by identical, growth in minimal and complete media (CM), by production sectors in the conidia. In protoplasts fusion of A. awamori with A. niger, was possible to isolate fusion products, but in low frequency

An overview on molecular markers for detection of ochratoxigenic fungi in coffee neans

Ochratoxin A (OTA) is one of the most abundant food-contaminating mycotoxins. Its occurrence in several agricultural commodities has been considered a worldwide problem. This toxin is mainly produced by Aspergillus species. OTA has nephrotoxic, immunosuppressive, and carcinogenic effects and consequently the contamination with this toxin represents a high risk for human and animal health. In the last 5 years, several investigators have applied molecular methods in order to develop PCR assays for identifying and quantifying OTA-producing fungi in coffee beans samples. The main objective is to allow the detection of microorganisms capable of producing OTA, preferentially prior to ochratoxin production and accumulation. In this contribution several of these attempts will be reviewed and discussed