Synthese und physiologische Funktion der chemischen Chaperone Ectoin und Hydroxyectoin

Eine unter Bakterien weit verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem Bereich der Synthese von den sogenannten kompatiblen Soluten aufgeklärt. Ein häufig genutztes kompatibles Solut in Bakterien ist das Tetrahydropyrimidinderivat Ectoin. Dieses kompatible Solut kann in einem weiteren enzymatischen Schritt durch eine Ectoin-Hydroxylase EctD zu Hydroxyectoin hydroxyliert werden. Um diese Hydroxylierungsreaktion besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit durch Röntgenstrukturanalysen die Kristallstruktur der Ectoin-Hydroxylase EctD aus V. salexigens in Zusammenarbeit mit der AG von Prof. Dr. K. Reuter (Universität Marburg) aufgeklärt. Die Ergebnisse aus der Kristallstruktur von EctD mit gebundenem Eisen, ein Vergleich des aktiven Zentrums der EctD Struktur mit Ectoin bindenden Substratproteinen aus Ectoin Transportern sowie der bioinformatische Vergleich von putativen EctD Proteinsequenzen führten zu einer Auswahl an Aminosäuren, die für eine Mutagenesestudie herangezogen wurden. Die Ergebnisse der Mutagenesestudie von hoch-konservierten Aminosäuren lieferten wichtige Informationen über deren Funktion und über den möglichen Synthesemechanismus des EctD Enzyms. Da man jedoch keine EctD Struktur mit gebundenem Substrat Ectoin oder Co-Substrat 2-Oxoglutarat erhalten konnte, wurden weitere potentielle Ectoin-Hydroxylasen aus verschiedenen Mikroorganismen kloniert und affinitätschromatographisch gereinigt. Alle gereinigten Ectoin-Hydroxylasen aus den Bakterien Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10, Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi, Acidiphilium cryptum und Halomonas elongata sowie dem Crenarchaeon N. maritimus waren enzymatisch aktiv. Dazu wurden die genauen Essaybedingungen jeder Ectoin-Hydroxylase in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration angepasst und optimiert. Danach erfolgte die enzymatische Charakterisierung und die Ermittlung der biochemischen Parameter wie Km, vmax und kcat. Durch weitere bioinformatische Analysen der ect Gene, die überwiegend als ein geschlossenes Gencluster in den Organismen organisiert sind, wurden weitere interessante Gene innerhalb des ect-Genclusters identifiziert. Dabei trat immer wieder ein für eine Aspartokinase kodierendes ask Gen auf. Die Aspartokinasen synthetisieren aus L-Aspartat den für die Ectoin Synthese wichtigen Vorläufer β-Aspartat-Semialdehyd im Zusammenschluss mit einem Asd Enzym. Im Genom des Bakteriums Pseudomonas stutzeri A1501 wurden zwei Gene für potentielle Aspartokinasen gefunden. Ein Gen befindet sich im ect-Gencluster und das zweite ask Gen ist an anderer Stelle im Genom lokalisiert. Die beiden Gene der Aspartokinasen wurden kloniert, die Proteine heterolog in E. coli produziert und durch enzymatische Tests charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten wichtige Unterschiede im Hinblick auf die Eigenschaften der beiden studierten Aspartokinasen in diesem Bakterium. In Wachstumsanalysen mit dem Actinomyceten Streptomyces coelicolor A3(2) wurde die physiologische Bedeutung der beiden kompatiblen Solute Ectoin und Hydroxyectoin untersucht. S. coelicolor wird durch Ectoin und Hydroxyectoin unter hohen osmotischen Bedingungen und hohen Temperaturen protektiert. Es konnte gezeigt werden, dass beim Einsatz eines 1:1 Gemischs von Ectoin und Hydroxyectoin diese Protektion am effektivsten ist. Des Weiteren wurde durch Transportstudien mit radioaktiv markiertem [14C]-Ectoin untersucht, bei welcher Salinität und bei welcher Temperatur die Aufnahme der kompatiblen Solute in S. coelicolor induziert wird. Durch die Kombination der beiden Stressfaktoren wie Hochsalz und hohe Temperatur, konnte gezeigt werden, dass in dieser Situation die Aufnahme am stärksten angeschaltet wird

Synthesis of 5-Hydroxyectoine from Ectoine: Crystal Structure of the Non-Heme Iron(II) and 2-Oxoglutarate-Dependent Dioxygenase EctD

As a response to high osmolality, many microorganisms synthesize various types of compatible solutes. These organic osmolytes aid in offsetting the detrimental effects of low water activity on cell physiology. One of these compatible solutes is ectoine. A sub-group of the ectoine producer's enzymatically convert this tetrahydropyrimidine into a hydroxylated derivative, 5-hydroxyectoine. This compound also functions as an effective osmostress protectant and compatible solute but it possesses properties that differ in several aspects from those of ectoine. The enzyme responsible for ectoine hydroxylation (EctD) is a member of the non-heme iron(II)-containing and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (EC 1.14.11). These enzymes couple the decarboxylation of 2-oxoglutarate with the formation of a high-energy ferryl-oxo intermediate to catalyze the oxidation of the bound organic substrate. We report here the crystal structure of the ectoine hydroxylase EctD from the moderate halophile Virgibacillus salexigens in complex with Fe3+ at a resolution of 1.85 Å. Like other non-heme iron(II) and 2-oxoglutarate dependent dioxygenases, the core of the EctD structure consists of a double-stranded β-helix forming the main portion of the active-site of the enzyme. The positioning of the iron ligand in the active-site of EctD is mediated by an evolutionarily conserved 2-His-1-carboxylate iron-binding motif. The side chains of the three residues forming this iron-binding site protrude into a deep cavity in the EctD structure that also harbours the 2-oxoglutarate co-substrate-binding site. Database searches revealed a widespread occurrence of EctD-type proteins in members of the Bacteria but only in a single representative of the Archaea, the marine crenarchaeon Nitrosopumilus maritimus. The EctD crystal structure reported here can serve as a template to guide further biochemical and structural studies of this biotechnologically interesting enzyme family

Synthese und physiologische Funktion der chemischen Chaperone Ectoin und Hydroxyectoin

Eine unter Bakterien weit verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem Bereich der Synthese von den sogenannten kompatiblen Soluten aufgeklärt. Ein häufig genutztes kompatibles Solut in Bakterien ist das Tetrahydropyrimidinderivat Ectoin. Dieses kompatible Solut kann in einem weiteren enzymatischen Schritt durch eine Ectoin-Hydroxylase EctD zu Hydroxyectoin hydroxyliert werden. Um diese Hydroxylierungsreaktion besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit durch Röntgenstrukturanalysen die Kristallstruktur der Ectoin-Hydroxylase EctD aus V. salexigens in Zusammenarbeit mit der AG von Prof. Dr. K. Reuter (Universität Marburg) aufgeklärt. Die Ergebnisse aus der Kristallstruktur von EctD mit gebundenem Eisen, ein Vergleich des aktiven Zentrums der EctD Struktur mit Ectoin bindenden Substratproteinen aus Ectoin Transportern sowie der bioinformatische Vergleich von putativen EctD Proteinsequenzen führten zu einer Auswahl an Aminosäuren, die für eine Mutagenesestudie herangezogen wurden. Die Ergebnisse der Mutagenesestudie von hoch-konservierten Aminosäuren lieferten wichtige Informationen über deren Funktion und über den möglichen Synthesemechanismus des EctD Enzyms. Da man jedoch keine EctD Struktur mit gebundenem Substrat Ectoin oder Co-Substrat 2-Oxoglutarat erhalten konnte, wurden weitere potentielle Ectoin-Hydroxylasen aus verschiedenen Mikroorganismen kloniert und affinitätschromatographisch gereinigt. Alle gereinigten Ectoin-Hydroxylasen aus den Bakterien Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10, Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi, Acidiphilium cryptum und Halomonas elongata sowie dem Crenarchaeon N. maritimus waren enzymatisch aktiv. Dazu wurden die genauen Essaybedingungen jeder Ectoin-Hydroxylase in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration angepasst und optimiert. Danach erfolgte die enzymatische Charakterisierung und die Ermittlung der biochemischen Parameter wie Km, vmax und kcat. Durch weitere bioinformatische Analysen der ect Gene, die überwiegend als ein geschlossenes Gencluster in den Organismen organisiert sind, wurden weitere interessante Gene innerhalb des ect-Genclusters identifiziert. Dabei trat immer wieder ein für eine Aspartokinase kodierendes ask Gen auf. Die Aspartokinasen synthetisieren aus L-Aspartat den für die Ectoin Synthese wichtigen Vorläufer β-Aspartat-Semialdehyd im Zusammenschluss mit einem Asd Enzym. Im Genom des Bakteriums Pseudomonas stutzeri A1501 wurden zwei Gene für potentielle Aspartokinasen gefunden. Ein Gen befindet sich im ect-Gencluster und das zweite ask Gen ist an anderer Stelle im Genom lokalisiert. Die beiden Gene der Aspartokinasen wurden kloniert, die Proteine heterolog in E. coli produziert und durch enzymatische Tests charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten wichtige Unterschiede im Hinblick auf die Eigenschaften der beiden studierten Aspartokinasen in diesem Bakterium. In Wachstumsanalysen mit dem Actinomyceten Streptomyces coelicolor A3(2) wurde die physiologische Bedeutung der beiden kompatiblen Solute Ectoin und Hydroxyectoin untersucht. S. coelicolor wird durch Ectoin und Hydroxyectoin unter hohen osmotischen Bedingungen und hohen Temperaturen protektiert. Es konnte gezeigt werden, dass beim Einsatz eines 1:1 Gemischs von Ectoin und Hydroxyectoin diese Protektion am effektivsten ist. Des Weiteren wurde durch Transportstudien mit radioaktiv markiertem [14C]-Ectoin untersucht, bei welcher Salinität und bei welcher Temperatur die Aufnahme der kompatiblen Solute in S. coelicolor induziert wird. Durch die Kombination der beiden Stressfaktoren wie Hochsalz und hohe Temperatur, konnte gezeigt werden, dass in dieser Situation die Aufnahme am stärksten angeschaltet wird

Biochemical properties of ectoine hydroxylases from extremophiles and their wider taxonomic distribution among microorganisms.

Ectoine and hydroxyectoine are well-recognized members of the compatible solutes and are widely employed by microorganisms as osmostress protectants. The EctABC enzymes catalyze the synthesis of ectoine from the precursor L-aspartate-β-semialdehyde. A subgroup of the ectoine producers can convert ectoine into 5-hydroxyectoine through a region-selective and stereospecific hydroxylation reaction. This compatible solute possesses stress-protective and function-preserving properties different from those of ectoine. Hydroxylation of ectoine is carried out by the EctD protein, a member of the non-heme-containing iron (II) and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. We used the signature enzymes for ectoine (EctC) and hydroxyectoine (EctD) synthesis in database searches to assess the taxonomic distribution of potential ectoine and hydroxyectoine producers. Among 6428 microbial genomes inspected, 440 species are predicted to produce ectoine and of these, 272 are predicted to synthesize hydroxyectoine as well. Ectoine and hydroxyectoine genes are found almost exclusively in Bacteria. The genome context of the ect genes was explored to identify proteins that are functionally associated with the synthesis of ectoines; the specialized aspartokinase Ask_Ect and the regulatory protein EctR. This comprehensive in silico analysis was coupled with the biochemical characterization of ectoine hydroxylases from microorganisms that can colonize habitats with extremes in salinity (Halomonas elongata), pH (Alkalilimnicola ehrlichii, Acidiphilium cryptum), or temperature (Sphingopyxis alaskensis, Paenibacillus lautus) or that produce hydroxyectoine very efficiently over ectoine (Pseudomonas stutzeri). These six ectoine hydroxylases all possess similar kinetic parameters for their substrates but exhibit different temperature stabilities and differ in their tolerance to salts. We also report the crystal structure of the Virgibacillus salexigens EctD protein in its apo-form, thereby revealing that the iron-free structure exists already in a pre-set configuration to incorporate the iron catalyst. Collectively, our work defines the taxonomic distribution and salient biochemical properties of the ectoine hydroxylase protein family and contributes to the understanding of its structure

Synthesis and Uptake of the Compatible Solutes Ectoine and 5-Hydroxyectoine by Streptomyces coelicolor A3(2) in Response to Salt and Heat Stresses▿

Streptomyces coelicolor A3(2) synthesizes ectoine and 5-hydroxyectoine upon the imposition of either salt (0.5 M NaCl) or heat stress (39°C). The cells produced the highest cellular levels of these compatible solutes when both stress conditions were simultaneously imposed. Protection against either severe salt (1.2 M NaCl) or heat stress (39°C) or a combination of both environmental cues could be accomplished by adding low concentrations (1 mM) of either ectoine or 5-hydroxyectoine to S. coelicolor A3(2) cultures. The best salt and heat stress protection was observed when a mixture of ectoine and 5-hydroxyectoine (0.5 mM each) was provided to the growth medium. Transport assays with radiolabeled ectoine demonstrated that uptake was triggered by either salt or heat stress. The most effective transport and accumulation of [14C]ectoine by S. coelicolor A3(2) were achieved when both environmental cues were simultaneously applied. Our results demonstrate that the accumulation of the compatible solutes ectoine and 5-hydroxyectoine allows S. coelicolor A3(2) to fend off the detrimental effects of both high salinity and high temperature on cell physiology. We also characterized the enzyme (EctD) required for the synthesis of 5-hydroxyectoine from ectoine, a hydroxylase of the superfamily of the non-heme-containing iron(II)- and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (EC 1.14.11). The gene cluster (ectABCD) encoding the enzymes for ectoine and 5-hydroxyectoine biosynthesis can be found in the genome of S. coelicolor A3(2), Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseus, Streptomyces scabiei, and Streptomyces chrysomallus, suggesting that these compatible solutes play an important role as stress protectants in the genus Streptomyces

Biochemical properties of the studied EctD-type proteins.

<p>The biochemical properties of the studied EctD-type proteins were determined as described in Material and Methods. The given temperature, pH and salt ranges describe a window in which the tested enzymes still exhibited some degree of activity.</p

Phylogenetic tree of EctC- and EctD-type proteins.

<p>The shown phylogenetic tree is based on the alignment of EctC amino acid sequences identified by a BLAST search at the JGI Web-server that were then aligned using ClustalW. These compiled amino acid sequences were then used to assess the phylogenetic distribution of the EctC protein using the iTOL Web-server. Evolutionary distances are not given. The color code indicates the distribution of EctC among members of the <i>Bacteria</i> and <i>Archaea</i>. The presence of an <i>ectD</i> gene in a given microbial species possessing <i>ectC</i> is indicated by black (<i>ectD</i> is part of the <i>ect</i> gene cluster) or red circles (<i>ectD</i> is located outside of the <i>ect</i> gene cluster). Purple circles are indicating the presence of an <i>ask_ect</i> gene associated with the <i>ect</i> gene cluster, whereas the presence of an <i>ectR</i> regulatory gene is indicted by green circles. If different strains of the same species were sequenced, only one representative symbolizes them. For instance, there are genomic data of 139 strain of <i>Vibrio cholerae</i> available in the database, each of which possesses an <i>ectABC</i> gene cluster, but only one of these sequences was used for the phylogenetic analysis.</p