Possibili meccanismi post trascrizionali implicati nella regolazione dell’ormone leptina.

Il gene ob codifica per la leptina, un ormone-citochina prodotto prevalentemente dal tessuto adiposo bianco (WAT) e considerato un importante segnale di sazietà: da cui il nome della proteina che deriva dal greco “lepthos”, magro. Mutanti spontanei di topo, deficienti per questo ormone, sviluppano una obesità grave in fasi molto precoci della vita. La leptina viene secreta in proporzione alla massa grassa totale e i suoi recettori sono stati individuati in nuclei ipotalamici implicati nella regolazione del bilancio energetico e di comportamenti associati alla nutrizione. L'innalzamento dei livelli plasmatici dell’ormone, causa l'attivazione di un pathway neuronale che determina una risposta anoressizante, mentre una loro diminuzione induce una risposta contraria. La leptina è interessata anche in altri processi, quali: maturazione dell’apparato riproduttivo e del sistema immunitario, angiogenesi, omeostasi del tessuto osseo, processi infiammatori. L'espressione della leptina è regolata da diverse condizioni croniche come: lo stato nutrizionale, l'eta' , il sesso e da stimoli acuti quali citochine, ipossia, beta-3agonisti, glucocorticoidi, insulina. I processi molecolari che stanno alla base di alcune di queste regolazioni non sono stati ancora chiariti. Non sono ad esempio noti elementi attivi in cis nella regione 5'-UTR del gene della leptina, che possano giustificare una regolazione da parte dell'insulina o dei glucocorticoidi. Gli elementi regolativi potrebbero quindi essere situati altrove, ad esempio nella lunga regione 3’ non tradotta (3’ UTR, circa 2700 basi) di quest’ormone che costituisce più dell’80% della lunghezza dell’intero messaggero. La regione 3' UTR di alcuni trascritti è ritenuta un elemento essenziale nella modulazione della stabilita' (emivita) degli stessi e della loro accessibilita' da parte del macchinario traduzionale; tali meccanismi sono chiaramente rilevanti nella modulazione della produzione proteica. Nei vertebrati, meccanismi di questo tipo, sono attivi ad esempio durante lo sviluppo embrionale di Xenopus e di topo e nel contesto di alcune funzioni apprendimento dipendenti in neuroni adulti. In generale si tratta di sistemi che consentono il mantenimento di trascritti "dormienti" (non tradotti) in distretti subcellulari e la loro "attivazione traduzionale" in seguito a precisi stimoli. La regolazione della lunghezza della regione 3'-UTR di questi trascritti attraverso un allungamento inducibile, a livello citoplasmatico, della coda di adenosine aggiunta in fase di maturazione nucleare dei trascritti, è stata messa in relazione con la loro attivazione traduzionale. Le tipologie cellulari interessate da questi meccanismi, sono accumunate da una estrema polarizzazione strutturale e molecolare. Tali sistemi di regolazione non sono mai stati descritti negli adipociti, ne’ studiati in relazione alla leptina. Tuttavia è noto, che nella 3’UTR di altre citochine sono presenti elementi consensus per il legame con proteine che regolano la stabilità e quindi l’ emivita dell’mRNA. Tali elementi sono caratterizzati da sequenze ricche in adenosine e uridine (A+U rich elements, AREs) e possono essere implicati nei processi di poliadenilazione citoplasmatica. Scopo della mia tesi è stato quello di stabilire se la regione 3’UTR della leptina possa essere implicata nella regolazione della produzione dell’ormone, attraverso un meccanismo di poliadenilazione variabile del messaggero. Poiché non esisteva in banca dati un clone completo del gene murino della leptina, abbiamo utilizzato la 3’ RACE per isolare la parte terminale del gene. Il sequenziamento di tale regione ha mostrato la presenza di alcune AREs , in particolare sono stati identificati : un segnale di poliadenilazione (esanucleotide altamente conservato AAUAAA) e alcuni elementi detti di poliadenilazione citoplasmatica (CPE) caratterizzati dalla sequenza consensus UAUUUUU(U) . La presenza dell'elemento CPE ha fatto ipotizzare che il 3'-UTR del trascritto della leptina potesse essere un target della proteina CPE-binding protein (CPEB), molecola precedentemente non caratterizzata negli adipociti, che gioca un ruolo chiave nei processi di regolazione della poliadenilazione citoplasmatica. La presenza di CPEB nel tessuto adiposo bianco, mai riportata fino a qui in letteratura, è stata da noi dimostrata sia tramite RT-PCR che analisi di Western Blot. Ci siamo quindi chiesti se il messaggero per la leptina subisse un allungamento variabile della coda di poliadenilazione e se questa potesse essere messa in relazione con la quantità di ormone prodotta. Si può evidenziare tale fenomeno con una paricolare tecnica di RT-PCR ancorata che, nel caso di una poliadenilazione variabile, dà luogo a dei prodotti di PCR visualizzabili su di un gel di agarosio come una banda principale con uno smear sovrastante. Questo è esattamente il pattern osservabile nel caso della leptina, utilizzando come materiale di partenza RNA estratto da tessuto adiposo bianco di topo. Il confronto tra topo geneticamente obeso, che sovraesprime l’ormone, e topo magro non ha tuttavia evidenziato differenze nella lunghezza o nell’aspetto dello smear; questo può essere messo in relazione con il fatto che i modelli utilizzati sono cronici e complessi. Per questo motivo abbiamo ritenuto opportuno valutare l’ allungamento della coda del messaggero per la leptina in un sistema più semplice, costituito da colture primarie di adipociti, trattate o meno con gli induttori della sintesi di leptina: insulina e dexametasone. La valutazione dei livelli dell’ormone rilasciato dagli adipociti nel mezzo di coltura tramite un saggio E.L.I.S.A. , ci ha permesso di verificare l’effetto positivo degli induttori utilizzati. Dati preliminari indicano che, soprattutto nei campioni trattati con l’insulina, si osserva una associazione positiva tra l’allungamento della coda di poliadenilazione e l’aumento di produzione di leptina. Con questo studio abbiamo quindi dimostrato che : 1. La regione 3’ non codificante del gene murino della leptina presenta elementi consensus per il legame con fattori che partecipano alla stabilizzazione dell’RNA maturo, in particolare si sono osservati elementi CPE. 2. Nel tessuto adiposo bianco di topo è presente almeno uno dei fattori che guidano la poliadenilazione citoplasmatica dei messaggeri, ovvero la proteina CPEB. 3. Il messaggero della leptina subisce una poliadenilazione variabile in vivo ed in vitro 4. L’insulina sembra modulare l’allungamento della coda in dipendenza della sua capacità di induzione sulla produzione di leptin

Ictal but Not Interictal Epileptic Discharges Activate Astrocyte Endfeet and Elicit Cerebral Arteriole Responses

Activation of astrocytes by neuronal signals plays a central role in the control of neuronal activity-dependent blood flow changes in the normal brain. The cellular pathways that mediate neurovascular coupling in the epileptic brain remain, however, poorly defined. In a cortical slice model of epilepsy, we found that the ictal, seizure-like discharge, and only to a minor extent the interictal discharge, evokes both a Ca2+ increase in astrocyte endfeet and a vasomotor response. We also observed that rapid ictal discharge-induced arteriole responses were regularly preceded by Ca2+ elevations in endfeet and were abolished by pharmacological inhibition of Ca2+ signals in these astrocyte processes. Under these latter conditions, arterioles exhibited after the ictal discharge only slowly developing vasodilations. The poor efficacy of interictal discharges, compared with ictal discharges, to activate endfeet was confirmed also in the intact in vitro isolated guinea pig brain. Although the possibility of a direct contribution of neurons, in particular in the late response of cerebral blood vessels to epileptic discharges, should be taken into account, our study supports the view that astrocytes are central for neurovascular coupling also in the epileptic brain. The massive endfeet Ca2+ elevations evoked by ictal discharges and the poor response to interictal events represent new information potentially relevant to interpret data from diagnostic brain imaging techniques, such as functional magnetic resonance, utilized in the clinic to localize neural activity and to optimize neurosurgery of untreatable epilepsies

Epileptiform activity in the mouse visual cortex interferes with cortical processing in connected areas

Epileptiform activity is associated with impairment of brain function even in absence of seizures, as demonstrated by failures in various testing paradigm in presence of hypersynchronous interictal spikes (ISs). Clinical evidence suggests that cognitive deficits might be directly caused by the anomalous activity rather than by its underlying etiology. Indeed, we seek to understand whether ISs interfere with neuronal processing in connected areas not directly participating in the hypersynchronous activity in an acute model of epilepsy. Here we cause focal ISs in the visual cortex of anesthetized mice and we determine that, even if ISs do not invade the opposite hemisphere, the local field potential is subtly disrupted with a modulation of firing probability imposed by the contralateral IS activity. Finally, we find that visual processing is altered depending on the temporal relationship between ISs and stimulus presentation. We conclude that focal ISs interact with normal cortical dynamics far from the epileptic focus, disrupting endogenous oscillatory rhythms and affecting information processing

New technologies for customizing products for people with special necessities: project FASHION-ABLE

[EN] Mass-customization of wearable products are offered as a higher added value to the broad public and have to compete with ready-to-wear offer. However, people with specific requirements are not covered by the current mass-customised products. This is the case of the elderly, disabled, diabetic and obese population groups when wearing textiles, clothing, footwear and textile-based orthotic goods. Further, at present, available knowledge and flexibility of production equipment and machinery of small and medium-sized enterprises operating in these traditional industries (even those that already offer made-to-measure products to the mass public) is unable to respond to the individual needs among such heterogeneous groups. The FASHION-ABLE project has solved this problem with a comprehensive set of solutions.This work was supported by the European Commission [project number FP7.FoF.NMP.2011-4 Project 284 871] under FASHION-ABLE project (http://www.fashionable-project.eu/) Area: 'High tech solutions in production [...] for [...] healthy consumer goods'.Durá-Gil, JV.; Ballester Fernández, A.; Cavallaro, M.; Chiodi, A.; Ballarino, A.; Brondi, C.; Von Arnim, V.... (2016). New technologies for customizing products for people with special necessities: project FASHION-ABLE. International Journal of Computer Integrated Manufacturing. 30(7):724-737. https://doi.org/10.1080/0951192X.2016.1145803S72473730

LAF 1.0: IMPLANTAÇÃO DE UM SISTEMA INFORMATIZADO PARA LABORATÓRIOS DE ANTROPOLOGIA FORENSE

Objective: A Software development for registration and recovery of information on Forensic Anthropology, based on the protocol developed during the project “UK – Brazil Scientific Cooperation – Forensic Anthropology and Identification of Human Remains”. Methods: Considering it is a Browser accessed application (software that allows Internet access, as Microsoft Internet Explorer®), it was necessary to choose an adequate programming language to this requirement as the server application. The chosen language was PHP® and the server application was Apache®. For data storage it was chosen the Data Bank Managing System MySQL®. Results: Tests performed with real data proved the LAF 1.0 efficiency, considering safety, reliability in storing and recovering data, as well as user satisfaction with clean, pleasant interfaces. This version was registered at the National Institute of Intellectual Property (INPI) and it is available for use in all medico-legal services interested in the creation of a Forensic Anthropology laboratory. Conclusions: The software improoved the generation of anthropological examination reports at Medico Legal Centre (CEMEL) and allowed the creation of a computerized tool for use in similar services, which will permit easiness in personal capacitating in Forensic Anthropology. Nowadays the software is in its updated version designated as LAF 2.0.Objetivo: Desenvolvimento de um software para cadastro e recuperação de informações em Antropologia Forense baseado no protocolo desenvolvido durante o projeto “UK –Brazil Scientific Cooperation – Forensic Anthropology and Identification of Human Remains”. Metodologia: Por se tratar de um aplicativo acessado via Browser (software que permite o acesso à Internet, como o Microsoft Internet Explorer®) foi necessária a escolha de uma linguagem de programação que se enquadrasse nesse requisito juntamente com uma aplicação servidora. A linguagem escolhida foi PHP® e a aplicação servidora foi o Apache®. Para o armazenamento dos dados foi escolhido o Sistema Gerenciador de Banco de Dados MySQL®. Resultados: Testes realizados com dados reais comprovaram a eficiência do LAF 1.0 em se tratando de segurança, confiabilidade no armazenamento e recuperação dos dados além de satisfação do usuário, com o visual limpo e agradável das interfaces. Esta versão foi registrada no Instituto Nacional de Propriedade Intelectual (INPI) e encontra-se disponível gratuitamente para uso em todos os serviços médico-legais interessados em implantar um laboratório de Antropologia Forense. Conclusões: O software agilizou a geração de laudos de exames antropológicos para o Laboratório de Antropologia Forense do Centro de Medicina Legal (CEMEL) e permitiu a criação de uma ferramenta informatizada gratuita para uso em outros serviços semelhantes, o que permitirá maior facilidade na capacitação de pessoal para o trabalho em Antropologia Forense. O software encontra-se atualmente em sua versão de atualização, denominada LAF 2.0. 

High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe

In utero electroporation is a powerful tool to transfect and manipulate neural-precursor cells of the rodent parietal cortex and their progeny in vivo. Although this technique can potentially target numerous brain areas, reliability of transfection in some brain regions is low or physical access is limited. Here we present a new in utero electroporation configuration based on the use of three electrodes, the relative position and polarities of which can be adjusted. The technique allows easy access and exceedingly reliable monolateral or bilateral transfection at brain locations that could only be sporadically targeted before. By improvement in the efficiency of the electrical field distribution, demonstrated here by a mathematical simulation, the multi-electrode configuration also extends the developmental timeframe for reliable in utero electroporation, allowing for the first time specific transfection of Purkinje cells in the rat cerebellum

Dendrimer-Based Fluorescent Indicators: In Vitro and In Vivo Applications

BACKGROUND: The development of fluorescent proteins and synthetic molecules whose fluorescence properties are controlled by the environment makes it possible to monitor physiological and pathological events in living systems with minimal perturbation. A large number of small organic dyes are available and routinely used to measure biologically relevant parameters. Unfortunately their application is hindered by a number of limitations stemming from the use of these small molecules in the biological environment. PRINCIPAL FINDINGS: We present a novel dendrimer-based architecture leading to multifunctional sensing elements that can overcome many of these problems. Applications in vitro, in living cells and in vivo are reported. In particular, we image for the first time extracellular pH in the brain in a mouse epilepsy model. CONCLUSION: We believe that the proposed architecture can represent a useful and novel tool in fluorescence imaging that can be widely applied in conjunction with a broad range of sensing dyes and experimental setups

Ictus ischemico monogenico. Incidenza su una coorte di pazienti afferenti alla U.O. di Neurologia

Scopo del presente lavoro di tesi e’ stato quello di analizzare retrospettivamente la casistica di pazienti afferenti agli Ambulatori di Neurogenetica Clinica e delle patologie cerebrovascolari della Clinica Neurologica a cui e’stata fatta diagnosi di ictus ischemico giovanile (esordio sotto i 50 anni di eta’) e valutare la frequenza in tale popolazione di patologie monogeniche correlati all’evento ictale. Il periodo di tempo preso in considerazione e’ il cinquennio 2008-2013

Optogenetic Methods to Investigate Brain Alterations in Preclinical Models

Investigating the neuronal dynamics supporting brain functions and understanding how the alterations in these mechanisms result in pathological conditions represents a fundamental challenge. Preclinical research on model organisms allows for a multiscale and multiparametric analysis in vivo of the neuronal mechanisms and holds the potential for better linking the symptoms of a neurological disorder to the underlying cellular and circuit alterations, eventually leading to the identification of therapeutic/rescue strategies. In recent years, brain research in model organisms has taken advantage, along with other techniques, of the development and continuous refinement of methods that use light and optical approaches to reconstruct the activity of brain circuits at the cellular and system levels, and to probe the impact of the different neuronal components in the observed dynamics. These tools, combining low-invasiveness of optical approaches with the power of genetic engineering, are currently revolutionizing the way, the scale and the perspective of investigating brain diseases. The aim of this review is to describe how brain functions can be investigated with optical approaches currently available and to illustrate how these techniques have been adopted to study pathological alterations of brain physiology

SmaRT2P: a software for generating and processing smart line recording trajectories for population two-photon calcium imaging

AbstractTwo-photon fluorescence calcium imaging allows recording the activity of large neural populations with subcellular spatial resolution, but it is typically characterized by low signal-to-noise ratio (SNR) and poor accuracy in detecting single or few action potentials when large number of neurons are imaged. We recently showed that implementing a smart line scanning approach using trajectories that optimally sample the regions of interest increases both the SNR fluorescence signals and the accuracy of single spike detection in population imaging in vivo. However, smart line scanning requires highly specialised software to design recording trajectories, interface with acquisition hardware, and efficiently process acquired data. Furthermore, smart line scanning needs optimized strategies to cope with movement artefacts and neuropil contamination. Here, we develop and validate SmaRT2P, an open-source, user-friendly and easy-to-interface Matlab-based software environment to perform optimized smart line scanning in two-photon calcium imaging experiments. SmaRT2P is designed to interface with popular acquisition software (e.g., ScanImage) and implements novel strategies to detect motion artefacts, estimate neuropil contamination, and minimize their impact on functional signals extracted from neuronal population imaging. SmaRT2P is structured in a modular way to allow flexibility in the processing pipeline, requiring minimal user intervention in parameter setting. The use of SmaRT2P for smart line scanning has the potential to facilitate the functional investigation of large neuronal populations with increased SNR and accuracy in detecting the discharge of single and few action potentials